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Helicobacter

Helicobacter pylori,
pylori, inflammation
inflammation
chronique
chronique et
et cancer
cancer gastrique
gastrique

Hilde de Reuse
(hdereuse@pasteur.fr)
Unit de Pathogense de Helicobacter
Institut Pasteur, PARIS

Jusquen 1983, on pensait que lestomac tait un


organe strile et que les ulcres de lestomac
taient causs par le stress

pH median de
lestomac = 2

Anciennes observations de bactries dans lestomac...

1886 :
identification de bactries spirales
dans des lavages gastriques
humains par Walery Jaworski
(Universit de Cracovie)

1893 : description de bactries


spirales dans lestomac dun
chien par Giulio Bizzozero
(Universit de Padoue)

Ces observations ne montrent pas


que la bactrie cause une maladie

En 1983 - le travail exemplaire de deux mdecins


australiens, R. Warren et B. Marshall

1) Analyse de biopsies de lestomac de 135 patients souffrant de gastrite


et de biopsies de patients sains
=> identification dune bactrie spirale uniquement chez les patients
souffrant de gastrite
2) Culture de cette bactrie pure in vitro
3) Barry Marshall dmontre lun des postulats de Koch en avalant une
culture de cette bactrie quils appellent Helicobacter pylori

2005: R. Warren et B. Marshall


Prix Nobel de Mdecine
pour la dmonstration du rle de la bactrie Helicobacter pylori
dans le dveloppement des maladies de lestomac

La bactrie Helicobacter pylori

Gram ngatif
Classe des epsilon protobactries
Spirale et fortement mobile

H.
H. pylori
pyloricolonise
coloniseexclusivement
exclusivement
lestomac
lestomacdes
des humains
humains
et
et des
desprimates
primatesnon-humains
non-humains

Helicobacter pylori : chef de file dun nouveau genre bactrien

Helicobacter pylori chef de file dun nouveau genre bactrien

Espces de Helicobacter ayant un tropisme prfrentiel pour l'estomac


Espces
Htes
"Cand idatus Helicobact erbov is"
Bovins
"Cand idatus Helicobact er he ilmann ii"
F lids sau vages, homm e s
"Flexisp ira" taxon 7
Ch iens
Helicobacter acinonych is
Gupard s
Helicobacter bacul iform is
Chats
Helicobacter biz zoz eron ii
Ch iens, chats, ho mmes
Helicobacter cetorum
Dauph ins, b lugas
Helicobacter cy nogas tricus
Ch iens
Helicobacter felis
Chats, ch iens, gup ards, homm es
Helicobacter mustelae
Furets
Helicobacter py lori
Homm es, primate s no n-ho miniens
Helicobacter sa lomon is
Ch iens, ho mmes
Helicobacter su is
Porcs, ho mmes, primates non -hominiens
"Helicobacte r suncus"
Musara igne
"Helicobacte r wingha mens is"
Homm es

Espces de Helicobacter ayant un tropisme prfrentiel


pour l'intestin et/ou le foie
Espces
Htes
"Flexisp ira"taxon10
Pr imates no n-hominiens
Helicobacter aurati
Ha msters
Helicobacter anser is
Oies
Helicobacter bilis
Sour is, rats, ha mst ers, gerbilles, ch iens,
chats, ov ins, porcs, homm e s
Helicobacter brantae
Oies
Helicobacter canadens is
Homm es, oie s
Helicobacter canis
Ch iens, chats, ho mmes
Helicobacter cholecystus
Ha msters
Helicobacter cinaed i
Homm es, ha mst e rs, ch iens , chats,
renard s, mac a que rhsus, rats
"Helicobacte r colifelis"
Chats
Helicobacter e quo rum
Chevau x
Helicobacter fennell iae
Homm es, primate s no n-ho miniens (?),
ch iens (?)
Helicobacter ganm ani
Sour is
Helicobacter hepat icus
Sour is, ho mmes (?)
Helicobacter mar m otae
Mar motte, ch a ts
Helicobacter mastom yrinus
Sour is, mast omys
Helicobacter mesocr ice torum
Ha msters
"Helicobacte r mur ico la"
Sour is sauvages
Helicobacter mur idarum
Rats, sour is
Helicobacter pamet ens is
Oiseau x, porcs, chats
Helicobacter pullorum
Vo la illes, ho mm es
Helicobacter rodentium
Sour is
Helicobacter trogo ntum
Rats, porcs, ovins
Helicobacter typhlon ius
Sour is
"Helicobacte r sp. Bird-B"
Oiseau x
"Helicobacte r sp. Bird-C"
Oiseau x
"Helicobacte r sp. cot ton -top tam arins"
Cotton -top ta mar ins

Infections par
Helicobacter pylori

- trs forte prvalence, la moiti de la population humaine mondiale


- fortes disparits gographiques (niveau socio-conomique)

Epidmiologie de linfection par


Helicobacter pylori
Mode de transmission :
- inter-humaine
- acquisition par voie oro-orale
- acquisition au cours de la petite enfance
- transmission le plus souvent intrafamiliale
- infection persiste souvent toute la vie

Prvalence des infections H. pylori

Dans les pays occidentaux => lincidence diminue


- 66 % de la population de lge de 60 ans est infecte
- 22 % de la population de lge de 20 ans est infecte
Effet cohorte

Pathologies associes linfection par H. pylori

<1a

Infection par H. pylori


20-30a

Gastrite chronique
(100%)

Asymptomatique
(80%)
Gastrite atrophique

Dyspepsie
fonctionnelle Ulcres gastriques
ou duodnaux (10%)
(5-10%)

30-50a

Mtaplasie intestinale

Lymphome
du MALT
(0.3%)

Dysplasie

Adnocarcinome (1-3%)

65-80a

Facteurs de lenvironnement
et mode de vie de lhte

Caractristiques gntiques
de lhte
Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires
-> TNF et IL1 (puissant inhibiteur de la scrtion
acide gastrique)

Risque accru
d'atrophie gastrique
et d'adnocarcinome

Gnotype de la bactrie
(lot de pathognicit Cag, VacA-s1m1)

Traitements des infections


Helicobacter pylori
Trithrapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline,
clarithromycine, ttracycline, mtronidazole)
+ inhibiteur de Pompe Protons (IPP)

Nouveaux traitements (90% radication)


- squentiel
- IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth

Apparition proccupante de souches rsistantes


Souches isoles de 530 biopsies (2004-2007, France)
26% clarithromycineR
61% mtronidazoleR
0% amoxicillineR
(Raymond et al. Helicobacter 2010)

Helicobacter pylori
et cancer gastrique
1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme
oncogne de classe I
par lagence internationale de recherche sur le cancer (IARC)

Cancers associs aux infections


Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 :
- 1.9 million de cas dans le monde
- 18% de lensemble des cancers

Principaux agents impliqus :


Bactrie :
Virus :

Helicobacter pylori 5.5%


Papilloma Virus humains 5.2%
Virus des Hpatites B & C 4.9%
Virus dEpstein-Barr 1%
VIH & HHV8 0.9%
HTL Virus 0.03%
Parasites du foie : 0.02%

cancers gastriques

(Parkin, Int J Cancer 2006)

Le cancer gastrique en chiffre


600 000 nouveaux cas/an dans le monde
2me cause de mortalit par cancer dans le monde
(2/3 des cas dans pays en voie de dveloppement)

800 000 morts par an dans le monde


En France : 6 000 nouveaux cas/an
Survie 5 ans : 10-15 %
Cancers gastriques associs H. pylori
90 % des lymphomes gastriques de type MALT
71 % des adnocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus)

- Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais

Sur les 280 patients non-infects par H. pylori ou infects et traits


aucun na dvelopp de cancer
Sur 1246 patients infects par H. pylori *
36 patients ont dvelopp un cancer (2,9%)
* 4,7 % Dyspeptiques
3,5 % Ulcres gastriques
2,2 % Polypes gastriques
0 % Ulcres duodnaux

Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001)

Comment linfection par H. pylori conduit au cancer gastrique ?


Processus trs long (>40 ans) multifactoriel - mcanismes encore mal compris.
H. pylori provoque une rponse inflammatoire chronique au niveau des cellules pithliales
de la muqueuse gastrique => conduit des lsions de l'ADN (espces ractives de l'oxygne
et de l'azote).
H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de
l"editing" d'ADN => gnre l'accumulation de mutations dans TP53.
(Matsumoto et al. Nature Med 2007)
L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes
de rparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009)
H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activits
augmentent le risque d'oncogense (VacA et CagA).

Activits de la cytotoxine VacA


Domaine
autotransporteur

Squence signal

s1 s2

i1

m
i2

m1

m2

Vacuolisation
Vacuolisation

Affaiblissement
Affaiblissementdes
des
jonctions
intracellulaires
jonctions intracellulaires

Formes plus frquemment associes


avec le cancer gastrique

p33

p55
Libration cytochrome C

Induction
Inductionde
de
l'apoptose
l'apoptose
Activit
Activitimmuno-suppressive
immuno-suppressive: :
vasion
vasionde
delalarponse
rponse
immunitaire
adaptative
immunitaire adaptative

(D'aprs Polk and Peek,


Nature Reviews Cancer, 2010)

Inhibition de la
fusion phagosome-lysosome

Macrophages

Altration de la
capacit prsenter
les antignes

Lymphocytes B

Integrin 2

Inhibition de l'activation
et de la prolifration

Cellules T

IL-2

L'lot de pathognicit Cag

cagA

30 gnes

- Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gnes,

H. pylori

prsent dans :

50 % des souches europennes


>95% des souches asiatiques

- souches Cag+ = facteur de risque pour le cancer


gastrique :
cancer => 95% Cag+
gastrite non-atrophique => 40 % Cag+
- Contient 22 gnes requis pour la synthse d'un

systme de scrtion de type IV (SST4)

40 kb

Membrane interne
Membrane externe

Cellule
pithliale

CagA,
une molcule pro-oncogne
injecte par le SST4 Cag

H. pylori

rcepteur
intgrines 5 1

Cellule
pithliale

CagA

SRC

P
SHP2

ABL

SST4

fragments de PG

Activation
Activationde
deNF-kB
NF-kB
=>
Stimulation
=> Stimulationde
delala
transcription
transcriptionde
delalacytokine
cytokine
pro-inflammatoire
pro-inflammatoireIL-8
IL-8

Nod1

CagA
CSK

at
Activ

- -Remaniement
Remaniementdu
ducytosquelette
cytosquelette

(augmentation
(augmentationde
delalamobilit
mobilitetetlongation
longationcellulaire)
cellulaire)

- -Prolifration
Prolifrationcellulaire
cellulaire

Viala et al.
Nature Immunol. 2004

male
r
o
n
-catenin
i on a

CagA

Hyperprolifration
Hyperprolifration
etetdiffrentiation
diffrentiation
aberrante
aberrante
ZO-1

CagA

JAM
Perturbation
Perturbation
- -des
jonctions
des jonctionsserres
serresetetadhrentes
adhrentes
- -de
delalapolarit
polaritcellulaire
cellulaire

(D'aprs
Polk and Peek,
Rle
du SST4
Cag
Rle
SST4
Cagdans
dansla
latransformation
transformationdes
descellules
cellulespithliales
pithlialesgastriques
gastriques
Naturedu
Reviews
Cancer, 2010)

Effet de lradication de H. pylori sur le


dveloppement du cancer gastrique
Traitement du MALT: 80 % de rgression aprs radication de H. pylori
Effet bnfique de l'radication de H. pylori sur l'volution des lsions pr-noplasiques
(Mta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007)

Gastrite
Gastritechronique
chronique

Atrophie gastrique
Amlioration dans l'antre et le corps

Mtaplasie intestinale
Aucune amlioration

Atrophie
Atrophiegastrique
gastrique
Point de
non-retour ?

Mtaplasie
Mtaplasieintestinale
intestinale
Dysplasie
Dysplasie
Adnocarcinome
Adnocarcinome

Conclusions

Helicobacter pylori : une bactrie de dcouverte rcente responsable de diverses


pathologies de l'estomac chez l'homme.

H. pylori colonise de manire persistante la moiti de la population humaine mondiale


(800 000 morts/an).

H. pylori = la seule bactrie reconnue comme oncogne de classe 1 (MALT et


adnocarcinome).

Adnocarcinome apparat aprs des dcades d'infection par H. pylori


mutagense de l'ADN des cellules htes (inflammation, AID).
diminution de l'expression de facteurs de rparation de l'ADN.
expression de facteurs de virulence (VacA et Cag) qui augmentent le risque d'oncogense.

L'radication de H. pylori fait rgresser le MALT et elle est bnfique pour l'volution des
lsions pr-oncognes.

H. pylori possde des proprits uniques


qui lui permettrent de survivre
et de se multiplier long terme dans
lestomac, un organe pourtant hostile...

Barrire chimique : acidit


pH mdian : 2

pH 4.5-6

Barrire physique :
mucus trs pais

pH neutre

cellules
pithliales

Adapt de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an


introduction" editeur Pearson

Barrire biologique :
rponse immunitaire

Barrire
Barrire immunologique
immunologique
Motifs Lewis : mimtisme molculaire

Immuno-suppression

Barrire
Barrire physique
physique :: mucus
mucus trs
trs pais
pais
Forme spirale pour pntrer dans le mucus

Flagelles pour se dplacer dans le mucus

Barrire
Barrire chimique
chimique :: pH
pH trs
trs acide
acide
H+

H+

H+

H+

Urase
2 NH3 + CO2

H+
NH2-C-NH2 + H2O
=

H+

NH4+

Urease
Urease :: un
un facteur
facteur de
de virulence
virulence
majeur
majeur de
de H.
H. pylori
pylori
- Enzyme essentielle pour la rsistance l'acidit, indispensable
la colonisation de modles animaux
- Urease : 10% protines totales de H. pylori
- Urase de H. pylori, la plus active de toutes les urases
dcrites (Km=0,2-0,5 mM)
- Au niveau des cellules pithliales gastriques de l'hte
- l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique
- la prsence d'ammoniac acclre l'induction de l'apoptose induite par
la cytokine TNF

Urease : une mtalloenzyme nickel


Ni2+

24 nickel ions par complexe actif


d'urase [(UreA-UreB)3]4

Urase :
une arme double tranchant
- pH acide : activit indispensable la survie de H. pylori
- pH neutre : production d'ammoniac dltre car conduit
un pH alcalin toxique pour H. pylori

Ni2+

Tests de la rponse de H. pylori l'acidit in vitro


2x108 bact./ml
PBS pH 7.0

H. pylori

PBS pH 2
+ 10mM ure

PBS pH 7.0
+ 10mM ure

37C - 1 H

pH

Compte-viable des bactries

Incubation sans ure


pH initial

9
8
pH = 77
6
5
4
3
pH = 22
1
0

Incubation avec ure


pH initial

pH final

pH = 7
108 CFU/ml

pH = 2

1 H1

9
8
pH = 77
6
5
4
3
pH = 22
1
0

pH final

Toxique

pH = 9
pH = 6.5
108 CFU/ml

1 H1

Ncessit pour la bactrie de contrler son activit urase

Plusieurs niveaux de contrle de


l'activit urase chez H. pylori
Identification de mcanismes originaux
- Accessibilit de son substrat, l'ure
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif
- Stockage du nickel

Ure

H+

UreI

Canal ure
Ure

P
ureA ureB

ureI ureE ureFureG ureH

Sous-units
catalytiques

Protines accessoires
Ni2+

UreHEFG

(UreA-UreB)6
Construction d'un mutant de H. pylori ureI
-> activit urase identique celle de la souche sauvage (sur des lysats)
Skouloubris et al. Infect & Immun 1998
Bury-Mon et al. Mol Microbiol 2001 et 2004

Incubation avec ure


pH initial

9
8
pH = 77
6
5
4
3
pH = 22
1
0

pH final

pH initial

pH = 9
pH = 6.5
108 CFU/ml

1 H1

Souche de H. pylori sauvage

9
8
pH = 77
6
5
4
3
pH = 2
1
0

pH final

pH = 9

pH = 2.5
105 CFU/ml

1 H1

Mutant de H. pylori ureI

UreI est ncessaire pour la survie de H. pylori pH acide en prsence d'ure


Dmonstration du transport de l'ure pH acide par UreI dans un systme
htrologue (oocytes de Xnopes) Weeks et al. 2001

Inoculation par voie orogastrique


de 109 bactries
(souche SS1)

108

4 semaines

107
(CFU/g estomac)

Charge bactrienne

Sacrifice

109

106
105
104
103

H. pylori sauvage
H. pylori ureI
Contrle ngatif

102
101
0
0

10

14

20

28 jours

Compte-viable
(Skouloubris et al. I&I 1998)

La protine UreI est essentielle pour la colonisation


d'un modle animal par H. pylori

H+

H+

H+

H+

H+
H+

H+

Ure

UreI

Ure

H+

H+

H+

NH4+

NH3 + CO2

Urase
Urase

UreI
UreI == canal
canal ure
ure dans
dans la
la membrane
membrane interne
interne
de
de la
la bactrie
bactrie ouvert
ouvert uniquement
uniquement pH
pH acide
acide
(cible
(ciblethrapeutique
thrapeutique--brevet)
brevet)

Plusieurs niveaux de contrle de


l'activit urase chez H. pylori
Identification de mcanismes originaux
- Accessibilit de son substrat, l'ure
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif

L'acquisition des mtaux par les bactries


pathognes au sein de leur hte
est un lment de virulence
Nickel

Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se


procurer du nickel dans lestomac de son hte

Acquisition du nickel par H. pylori


Environnement gastrique :
- complexe et vari
- biodisponibilit des ions mtalliques ?
Concentration du nickel dans le corps
humain est trs faible : 2-11 nM

MI
ME

Ni

?
2+

NixA

Comment le nickel est-il


transport travers la membrane
externe (ME) ?
Aucune source d'nergie
disponible au niveau de la ME

Le complexe TonB/ExbB/ExbD fournit de l'nergie pour le


transport travers la membrane externe (ME) en utilisant la
force proto-motrice de la membrane interne (MI)
Transporteur
Substrate-binding
site
Transporteur

dpendant
dpendantde
de
TonB
=
TBDT
TonB = TBDT

ME

Substrats du systme TonB :


Fer

chlat (sidrophores)

Cobalamin, vitamine B12 (cofacteur cobalt)

MI
Modified from Braun & Braun

La
La machinerie
machinerie ExbB/ExbD/TonB
ExbB/ExbD/TonB est
est implique
implique
dans
dans le
le transport
transport du
du fer
fer chez
chez H.
H. pylori
pylori

Question:
Question: est-ce
est-ce que
que TonB
TonB est
est
requis
requis pour
pour le
le transport
transport
nergis
nergis du
du nickel
nickel ??
Kristine SCHAUER

Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de


"Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS)
mol Ni2+ /g prot

Ni2+

pH 7

pH 5

mutant exbB-exbD-tonB
+ mutant complment

A pH 7, peu de nickel accumul indpendamment de TonB


A pH 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dpend de TonB

Identification
Identification du
du transporteur
transporteur TonB-dpendant
TonB-dpendant
FrpB4
prsente les caractristiques d'un TBDT
localise dans la membrane externe
(Ernst et al. 2006 J. Bact)
rgule par NikR en rponse au nickel
(Muller et al. 2011 NAR)

Mutant frpB4, mme phnotype que


le mutant exbB-D-tonB

Modified from Braun & Braun

Consquences du transport du nickel


TonB-dpendant sur l'activit urase
pH 7

A pH 7, accumulation du nickel
TonB-indpendante
=> activation de l'urase

pH 5

A pH 5, des faibles doses de nickel


=> Machinerie ExbB/ExbD/TonB +
FrpB4 ncessaires l'activit urase

Premire dmonstration d'un transport du nickel travers la ME


par un mcanisme dpendant de la machinerie TonB
Nickel
H+

ME

FrpB4 = Transporteur de
nickel dpendant de TonB

FrpB4

Transport de nickel est activ


pH acide
TonB

H+

ExbB

MI

ExbD
NixA

Activation de l'urase pH
acide par l'apport de nickel

PMF

Schauer et al. Molec Microbiol (2007)


Urase

Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008)

Plusieurs niveaux de contrle de


l'activit urase chez H. pylori
Identification de mcanismes originaux
- Accessibilit de son substrat, l'ure
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif

Incorporation du nickel dans l'urase


par des complexes protiques
Carte gnomique d'interaction protiques par paires (Y2H)
Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003)

Purification de complexes protiques par la technique TAP,


Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL)
Purification de complexes multiprotiques partir de l'organisme
d'origine
=> Meilleure spcificit des
complexes (moins de faux positifs)

Recherche de complexes protiques


associs l'urase chez H. pylori par TAP

Identification
Identification de
de deux
deux
populations
populations de
de complexes
complexes
--un
un complexe
complexeenzymatique
enzymatiqueactif
actif
associ
assocides
desenzymes
enzymesdu
du
mtabolisme
mtabolismede
deNH
NH33
--un
un complexe
complexed'incorporation
d'incorporation du
du
nickel
nickelpartag
partagavec
aveccelui
celuide
de
l'hydrognase
l'hydrognase(distribution
(distribution du
du nickel)
nickel)

Urease

Ni 2+

Complexes protiques
pour l'incorporation du
nickel

2
Ni

Hydrogenase

Ni2+

FrpB4
TonB-ExBD

NixA

Ni2+

Ure
H+

Ure

Nouveaux
Nouveaux mcanismes
mcanismes pour
pour
l'acquisition
l'acquisition du
du nickel,
nickel,
activs
activs bas
bas pH
pH

UreI

Complexes
Complexes protiques
protiques
pour
pour l'incorporation
l'incorporation
du
du nickel
nickel

Urease
Urease

H+

Canal
Canal ure
ure activ
activ
pH
pH acide
acide

Hydrogenase
Hydrogenase

Helicobacter pylori
est une bactrie fascinante !
- il reste beaucoup daspects de sa virulence comprendre
- elle constitue un bon systme dtude
* pour comprendre les processus qui conduisent au cancer
* pour identifier de nouveaux mcanismes ou de nouvelles
fonctions dont certains peuvent tre communs dautres
bactries pathognes

Pour en savoir plus sur H. pylori

http://www.helicobacter.fr./

Sylvie AUBERT

ERL3526

Julien GALLAUD
Daniel VINELLA
Yulia REDKO
Karine ANGER
Valrie MICHEL
Eliette TOUATI
Julien FERNANDES
Hilde DE REUSE

Unit Pathogense de Helicobacter


Mireille FERRAND

Mcnat
Janssen
ODYSSEY-Re

Laboratoire de Chimie et Biologie des


Mtaux (CEA/CNRS Grenoble)
Christelle BALHAWANE
Isabelle MICHAUD-SORET

Groupe de Cristallographie
Macromolculaire (ESRF Grenoble), now at
IBCP Lyon
Cyril DIAN
Laurent TERRADOT
Burnham Institute, La Jolla USA
Dmitry RODIONOV

Laboratoire de Cristallographie et
Cristallogense des Protines
(CEA/CNRS Grenoble)
Christine CAVAZZA
Laboratoire CEA de Cadarache
DSV/IBEB/SBVME/LB3M
Pierre RICHAUD
Gnopole IP
(Proteopole)
Pascal LENORMAND
Jean-Claude ROUSSELLE
Abdelkader NAMANE

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