PRCTICA # 5

CINTICA
ENZIMTICA 2:
EFECTO DEL PH Y
TEMPERATURA

Experimento No. 1
Efecto del pH

Tubo

Sacarosa 0.3
M

1.0
ml

1.0 ml 1.0
ml

1.0
ml

1.0
ml

1.0
ml

1.0 ml

Amortiguador 0.5
ph 2.5
ml

Amortiguador 0
ph 3.5

0.5 ml 0

Amortiguador 0
ph 4.5

0.5
ml

Amortiguador 0
ph 5.5

0.5
ml

Amortiguador 0
ph 6.5

0.5
ml

Amortiguador 0
ph 7.5

0.5
ml

Invertasa

1.0
ml

1.0 ml 1.0
ml

1.0
ml

1.0
ml

1.0
ml

1.0 ml

Agua

1.5 ml

Mezclar e incubar a 35C durante 20 min. Posteriormente

agregar 1 ml de Dinitrosalicilato a cada uno de los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin hasta
cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero
con el tubo No. 7

Resultados
Tubos

Absorbancia
540

Ph

0.005

2.5

0.006

3.5

0.969

4.5

1.264

5.5

1.302

6.5

1.271

7.5

Segn los resultados obtenidos se determina que el ph al que

la enzima Invertasa alcanza su mayor punto de actividad enzimtica
es de 6.5 por lo cual se considera su ph optimo

Conclusiones

Al pH en donde la enzima presenta mxima

actividad se le conoce con el nombre de pH
ptimo. Estos resultados se pueden interpretar
pensando que en el pH ptimo la enzima tiene
la conformacin tridimensional que le permite
la mayor actividad cataltica. Si se modifica este
pH, la conformacin nativa se pierde y la
enzima ya no puede catalizar adecuadamente.

Efecto del pH en la ionizacin del sitio activo: la

concentracin de H+ afecta la velocidad de la
reaccin el proceso cataltico usualmente requiere
de que la enzima y el substrato tengan grupos
qumicos en una forma ionica particular para poder
interactuar. Por ejemplo la actividad cataltica
puede necesitar a un grupo amino en estado
protonado (-NH3+) o no (-NH2+), el pH modifica
este estado y por tanto a la velocidad de la
reaccin.

Efecto del pH para la desnaturalizacin de la

enzima: pH extremos pueden ocasionar la
desnaturalizacin de las enzimas, debido a que la
estructura con estos cambios es posible modificar
las interacciones ionicas que intervienen en la
estabilidad de la enzima en su estado nativo.

El mtodo DNS (tcnica de miller) es una tcnica

colorimtrica que emplea cido 3,5 dinitrosaliclico
para la hidrlisis de polisacridos presentes en una
muestra. Determina las absorbancias por medio de
un espectrofotmetro a 540nm para cuantificar los
productos de una reaccin enzimtica.

El DNS reacciona nicamente con los azcares

reductores. La sacarosa es un disacrido no
reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se
liberan glucosa y fructosa que s son reductores y
reaccionan con el DNS generando un producto
coloreado. La intensidad del color, que se puede
medir por mtodos espectrofotomtricos es
proporcional a la concentracin de sacarosa.

Experimento No. 2 Efecto

de la Temperatura

Tubo

Sacarosa
0.3

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Amortiguad
or PH 4.7

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Invertasa

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Agua

1.0

26

37

45

60

100

25

temperatura 4

Mezclar e incubar 20 minutos a la temperatura indicada.

Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin hasta
cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero
con el tubo No. 7

Resultados
Tubo

Absorbancia
540

Temperatura

0.834

1.842

26

2.039

37

2.008

45

2.235

60

1.463

100

Segn los resultados obtenidos se observa que el punto

De temperatura a la que la Invertasa alcanza su mayor actividad
Enzimatica es de 60 c por lo cual se considera su temperatura optima

conclusiones

Incremento de la velocidad con la temperatura: En

general, la velocidad de la reaccin se incrementa
con la temperatura hasta que un punto mximo es
alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta
el nmero de molculas ricas en energa que
pueden pasar la barrera energtica de estado de
transicin, para formar a los productos.

Sin embargo la elevacin excesiva de la

temperatura del medio que contiene a las enzimas,
resulta en un decremento de la velocidad como
resultado de la desnaturalizacin, es decir, la
prdida de la estructura tridimensional de las
enzimas y en consecuencia perdida de los sitios
activos evitando la transformacin del sustrato
dando como resultado la disminucin de la actividad
cataltica