UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS UFMG

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS-ICB

PROGRAMA DE PS GRADUAO EM MICROBIOLOGIA

Lucas e Jefferson.
ICB, UFMG
Belo Horizonte, Brasil

 A maioria da populao do mundo vai sofrer com infeces

infeces em algum momento durante sua vida.

infeces fngicas invasivas so responsveis para cerca de 1,5

milhes de mortes a cada ano, mais do que a tuberculose ou a
malria.

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Infeces fngicas no so geralmente reconhecidos

Mais de 90% das infeces fngicas fatais so causadas por
espcies que pertencem ao gnero Cryptococcus, Candida,
Aspergillus, Pneumocystis.

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 C. neoformans

imunocomprometidos

https://washingtoncandido.wordpress.com/2011/02/15/

Cryptococcus neoformans.
Cryptococcus gatti

C.gatti

C.neoformans

Severo
Severoetetal.,2009
al.,2009

 Desenvolvimento de drogas
Regimes de drogas antifngicas com base em azoles,
flucitosina, e anfotericina B pode ser eficaz no tratamento de
ambas as espcies de Cryptococcus.
Uso contnuo de azlicos
Resistncia

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Objetivo :identificar genes essenciais de C. neoformans

21 genes so conhecidos

Genes essenciais foram identificados a partir de telas

de mutantes em outros fungos tais como A. fumigatus

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

Fungos ascomicetos :Saccharomyces spp

Ascomicetos
Basidiomicet
os

Cryptococcus spp
IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

MTODO
Estirpes e condies de cultura: C. neoformans var.grubii
estirpe AI187 (ADE2 / ADE2 ura5 / URA5 MATa / MAT;
FGSC 10993). ( YPD)

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Insero:
Agrobacterium tumefaciens

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

Substituio do gene alvo

Um total de 509 genes de C. neoformans foram encontrados

em outros fungos, mas no mamferos.

91 genes so relatados como essencial em S. cerevisiae e S.

pombe , mas sem homlogos de mamfero .

Compilou essas informaes e excluindo os genes essenciais

j conhecidas de C. neoformans, foram selecionados 35 genes
para anlise em C. neoformans (Tabela 2).
IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

Anlise gentica

Semeadas em placas de meio MS para induzir a meiose e esporulao.

Para cada cepa, pelo menos 30 basidisporos haplides de populaes
mistas foram dissecados sobre placas de YPD.
Testados para os quatro marcadores genticos que segregam durante a
meiose (Nourseothricin resistncia [NATR] ou sensibilidade [NATS],
URA5, ADE2)

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Manipulaes de ADN ( extrao/PCR inverso)

Comparao de bioinformtica dos genes essenciais do
Cryptococcus neoformans

32 genes essenciais identificadas no

presente estudo forward e reversa (Tabelas
1 e 2), 19 genes essenciais conhecidos
previamente relatado na literatura)

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Tela gentica e anlise fenotpica: (utilizando os mutantes

heterozigotos e NAT vivel da prognie haploide mutante
N.Essenciais)

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

Exemplos representativos de mutantes com inseres em genes essenciais

identificadas por telas genticos
I

Supresss
o

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

RESULTADOS

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Um total de 2.665 mutantes de insero de C. neoformans

foram selecionados e testados:

127

Selecionado para anlise fenotpica e molecular por no apresentar

crescimento
aps a transferncia de culturas (YPD).
IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

127

Anlise de Southern Blot

94 cepas tiveram DNA inserido

pela transferncia (T-DNA), 26
tinham dois,
6 tinha trs, e uma cepa tinha
quatro.

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 A fim de identificar os genes afetados pela insero

PCR

Cinquenta e seis cepas foram

caracterizados

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Vinte e sete cepas (27) eram incapazes de produzir cadeias de

basidisporos.
A reproduo sexual foi restaurado com xito em cinco (5)
cepas aps o cruzamento, e dois desses mutantes no foram
viveis NATR na prognie.

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 No total, 15 mutantes heterozigticos que foram incapazes de produzir NAT

vivel foram isolados atravs da anlise gentica, com 11 possuindo uma nica
insero de ADN-T e o restante estirpes com duas inseres.
Anlise de segregao de basidisporos haplides que germinaram a partir de
1d53 revelou que eles estavam todos sensveis a nourseothricina , confirmando
que TRR1 um gene essencial

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Para 41 mutantes de insero heterozigotos selecionados , levou anlise

mendeliana de um nico mutante esporulado.
9 cepas teve insero
viabilidade.

em S. Cerevisiae ortlogos necessrio para a

8 amostras foram incapaz de produzir basidisporos.

Alm disso, 6 outras estirpes teve inseres prximas.

IANIRI, G.; IDNURM, A, 2015

 Genes envolvidos na sntese do ergosterol;

ERG8 e MVD1 essenciais em C. neoformans;

BUR6, CET1, HRB1, SEN54 e TRL1 funes relacionadas

a RNA;

BYR4 ativador de GTPase em S. pombe.

DETECO DE LINHAGENS DOENTES:

VIA DE RAM (HYM1)
Tcnica de germinao de basidiosporos vantagens;

Via de RAM conservada em eucariotos;

6 genes caracterizados S. cerevisiae e S. pombe;

Mutao em RAM morfologia de pseudohifa em C. neoformans;

Mutao em todos os 5 HYM1 nunca

COMPARAO BIOINFORMTICA PARA

PRIORIZAO DE ANTIFUNGICOS
Protena ideal afeta o patgeno e no o humano;

Fks1 -1,3-glucana;

56 genes de C. neoformans BLAST comparados S. cerevisiae e

Homo sapiens;

Comparados C. albicans e A. fumigatus patgenos humanos;

56

19

32 essenciais identificados no presente estudo;

previamente reportados na literatura

 5 conhecidos alvos de drogas:

1. FKS1 alvo de equinocandinas;
2. ERG1 ergosterol
3. ERG11 ergosterol
4. CDC60 codificador de tRNA sintetase (AN2690)
5. EFT2 fator de elongao

GENTICA QUMICA E PERFIS DE

HAPLOINSUFICINCIA INDUZIDA
Analises fenotpicas funo dos genes na clula;

Mutantes heterozigos e haploides traos de virulncia ,

drogas e estresse.

Todas as linhagens selecionadas testadas como nico

ponto.

OBRIGADO!!!