TEMA

EXTRACCIN DE ADN, ARN Y

PROTENAS

Integrantes:

-Martnez len, Sandra

-Santiago Isla Albina
-Chvez ,Josu
-Garca, Alan
-

Ciclo:

Seccin:
IX

Asignatura:
- Biologa Molecular
Docente:
- Q.F. Minaya Galarreta, Angelica

- 2A

Es Importante Diferenciar:
Extraccin:

sacar los componentes desde un

compartimento celular. Involucra:
Lisis

de las clulas que contienen a los AN

Inactivacin de nucleasas
Clarificacin: separacin de los AN de los restos
celulares.

Purificacin:
De

Separacin de AN:

protenas solubles
De otros AN no deseados
De Lpidos, carbohidratos
De sales y otros compuestos orgnicos

Introduccin

cidos Nucleicos

Los cidos nucleicos almacenan la

informacin
gentica
de
losorganismos vivosy son los
responsables de la transmisin
hereditaria.
Gran parte del desarrollo fsico de
un organismo a lo largo de su vida.
Las protenas que elaboraran sus
clulas y las funciones que
realizaran estn todas registradas
en esta cinta molecular.
Existen dos tipos: elADNy
elARN.

EL ADN
Es
Es una
una macromolcula
macromolcula muy
muy larga
larga ,,
filamentosa
y
formada
por
filamentosa
y
formada
por
desoxirribonucletidos,
desoxirribonucletidos, cada
cada uno
uno de
de ellos
ellos
compuesto
compuesto por
por una
una base
base nitrogenada,
nitrogenada, un
un
azcar
azcar desoxirribosa
desoxirribosa y
y un
un grupo
grupo fosfato.
fosfato.

EL ARN

El
El ARN
ARN tiene
tiene una
una sola
sola
hebra.
hebra.

pentosa
de
los
La
La
pentosa
de
los
nucletidos
nucletidos constituyentes
constituyentes
es
es ribosa.
ribosa.

Sus
Sus cuatro
cuatro bases
bases son:
son: A,
A,
G,
G, C,
C, U.
U.

Es
Es lamolculaque
lamolculaque dirige
dirige
las
las etapas
etapas intermedias
intermedias de
de
la sntesis proteica.

Tipos de ARN

ARNr:
ARNr: Recibe
Recibe la
la informacin
informacin
gentica.
gentica. Traduce
Traduce las
las protenas.
protenas. Se
Se
ubica
ubica en
en el
el ribosoma,
ribosoma, organela
organela
donde
donde se
se sintetiza
sintetiza las
las protenas.
protenas.

Historia:

Mtodos
de
Extraccin
de
cidos
Nucleicos:

Extraccin de
cidos Nucleicos por Mtodos
Convencionales:

MTODOS DE FRAGMENTACIN Y LISIS

CELULAR PARA LA EXTRACCIN DE AN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza
necesaria para romper el material de inicio (clulas o
tejido) y la delicadeza requerida para preservar las
molculas de inters (ADN o ARN).
Mtodos fsicos
Homogenizacin mecnica,
Homogenizacin en solucin
Molienda manual en mortero
Bolitas de vidrio
Sonicacin

Mtodos enzimticos
Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murmico y N-acetil
glucosamina de peptidoglicn de la pared celular de bacterias
Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras
Proteasas: rompe enlaces peptdicos de prot. de pared y
membrana plasmtica e interacciones clula-clula.

Mtodos qumicos
Detergentes

LISIS CELULAR

2. CLARIFICACIN. ELIMINACIN DE RESTOS CELULARES

(DEBRIS)

Centrifugation
Centrifugation
Filtracin
Filtracin
Mtodo
Mtodo mixto:
mixto: enzimas
enzimas +
+
centrifugacin
centrifugacin

3. Purificacin

Por
Por qu
qu purificar?
purificar?
Nucleasas
Nucleasas que
que se
se liberan
liberan al
al lisar
lisar las
las clulas
clulas degradan
degradan los
los cidos
cidos
nucleicos.
nucleicos.
Tcnicas:
Tcnicas:
Desproteinizacin
Desproteinizacin con
con fenol,
fenol, que
que al
al desnaturar
desnaturar protenas
protenas causa
causa su
su
precipitacin.
precipitacin.
Precipitacin
Precipitacin de
de protenas
protenas con
con sales
sales (salting
(salting out)
out)

Extraccin Con Tiocianato de GuanidinoFenol-Cloroformo

(Mtodo de Chomczynski)

1. Extraccin de ADN Solucin Chomczynski

1. Extraccin de ARN Solucin Chomczynski

2. Extraccin de ADN Plsmico por Lisis

Alcalina
Se
Se usa
usa principalmente
principalmente
extraccin
de
extraccin
de
plasmdico
plasmdico de
de E.
E. coli.
coli.

para
para
ADN
ADN

Fundamento del mtodo:

Se basa en las diferencias en la
desnaturalizacin,
renaturalizacin
del ADN plasmdico y el ADN
cromosmico al aplicar NaOH
en
presencia de un detergente
fuertemente aninico como el
Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y
Acetato de potasio.

2. Extraccin de ADN Plsmico por Lisis

Alcalina
ADN plasmidico-pequeos circulos cerrados covalentemente
ADN cromosmico-fragmentado

3. Mtodo de Extraccin CTAB

Elaborado
Elaborado por
por Murray
Murray y
y
Thompson
Thompson en
en 1980.
1980.
-- Adecuado
Adecuado para
para extraer
extraer y
y
purificar
purificar ADN
ADN de
de vegetales
vegetales y
y
especialmente
especialmente indicado
indicado para
para
eliminar
eliminar los
los polisacridos
polisacridos y
y los
los
compuestos
compuestos poli
poli fenlicos
fenlicos que
que
daaran
daaran al
al ADN.
ADN.
--

DIAGRAMA DEL METODO DE EXTRACION CTAB

4. Centrifugacin en gradiente de
Bromuro De Etidio Cloruro de cesio.
Este mtodo de
purificacin,
requiere cultivo
bacteriano
a
gran escala.

Utiliza un gradiente de cloruro de cesio

y el agente intercalante bromuro de
etidio para generar diferencias de
densidad entre el ADN superenrrollado
plasmdico (ccc) y el ADN lineal
cromosmico o plasmdico circular
abierto (oc).
El superenrrollado acepta menos
BrEt
y
ser
ms
denso,
apareciendo ms abajo tras la
centrifugacin
Se purifica por diferencia de
gradiente de densidad de
cloruro de cesio

4. Centrifugacin en Gradiente de BrEt

- CsCl

Purificacin de ARN Poli(A) por

cromatografa de celulosa de Oligo (dt)
Columnas de oligo
(dT)-celulosa.
- Retienen el ARNm al
tener una cola de
poli-A en 3con oligo (dT)
permiten:
separar
eficientemente el
ARNm mediante
separacin
magntica

Es un mtodo de purificacin.
El poli (A) ARN es un modelo para la
transduccin de la protena y la mayora
de los ARNms
Se compone de 1 a 2% del total de ARN ,
se puede separar por cromatografa de
afinidad en oligo (dt)- celulosa
Las colas de Poli (a) formas estables
cadenas cortas de ARN ADN hibrido con
oligo (dt)

EXTRACCIN DE CIDOS
NUCLEICOS EN FASE SOLIDA

Los sistemas de fase solida absorbern los

cidos nucleicos en el proceso de
extraccin dependiendo de:

El proceso de
absorcin se
basa en los
siguientes
principios

p
H

contenido de
sal de buffer

Unin mediante puentes de H con

una matriz hidroflicas bajo
condiciones caotrpicas

Intercambio Inico bajo

condiciones acuosas por medio
de un intercambio Aninico
Mecanismos de Exclusin por
afinidad y tamao

Eficacia
,rapidez
comparado
con los
mtodos
convencion
ales

La purificacin en fase
solida es efectuada por
el uso de columnas
giratorias operadas por
fuerzas centrifugas
Tipos
de
soporte(FE) que
se
han usado
como
apoyo
para
la
extraccin
en
fase slida

Matrices
de slice
Tierra de
diatomeas
Partculas
de vidrio
Transportado
res de
intercambio
inico

Purificacin en las Matrices de Slica

El principio est basado en la

elevada afinidad de las cadenas de
ADN cargadas negativamente con
respecto a las partculas de slicas
cargadas positivamente.

Purificacin en las Matrices de Slica

El sodio juega un rol como un catin enlazante

o puente que atrae el oxgeno cargado
negativamente en los fosfatos de las cadenas
de cidos nucleicos.

 PARTCULAS DE
VIDRIO

Gel de agarosa
involucrado en el uso de
sales caotrpicas facilitan
el enlazamiento de ADN
a vidrio comn de slice.
La absorcin de cido
nucleico es el sustrato de
vidrio , ocurre debido al
mecanismo y principio
similar al de la adsorcin
de cromatografa de
adsorcin.

TIERRA DE
DIATOMEAS

Es una roca
sedimentaria silcea
formada por micro
fsiles de diatomeas,
algas marinas
unicelulares que
secretan un esqueleto
sliceo llamado
frstula

Diatomita:

Quitan
Quitan el
el ADN
ADN trenzada
trenzada doble
doble pero
pero
no
no el
el ARN
ARN o
o las
las protenas.
protenas.

La
La diatomita
diatomita resultante
resultante enlazada
enlazada con
con el
el ADN
ADN
es
es luego
luego lavado
lavado con
con un
un tampn
tampn que
que contiene
contiene
alcohol.
alcohol.

Este
Este es
es luego
luego dejado
dejado de
de lado
lado y
y el
el ADN
ADN es
es
eludo
eludo en
en un
un tampn
tampn bajo
bajo en
en sal
sal o
o en
en agua
agua
destilada.
destilada.

Purificacin de cido Nucleico Basado en

Partculas Magnticas:
La
La separacin
separacin es
es una
una
forma
forma simple
simple y
y eficiente,
eficiente,
el
cual
es
utilizado
el
cual
es
utilizado
actualmente
en
la
actualmente
en
la
purificacin
de
cidos
purificacin
de
cidos
nucleicos.
nucleicos.
Usualmente,
portadores
Usualmente,
portadores
magnticos
magnticos con
con ligandos
ligandos
afinos
inmviles
o
afinos
inmviles
o
preparados
con
preparados
con
biopolmero
biopolmero que
que muestra
muestra
afinidad
afinidad al
al cido
cido nucleico
nucleico
a
a tratar
tratar son
son usados
usados en
en el
el
proceso
proceso de
de aislamiento.
aislamiento.

Purificacin de cido Nucleico Basado en

Partculas Magnticas:
Uso
Uso de
de perlas
perlas magnticas
magnticas implica
implica
cuya
cuya superficie
superficie tiene
tiene una
una carga
carga que
que
se
se puede
puede cambiar
cambiar basndose
basndose en
en el
el
pH.
pH.
A
A pH
pH bajo
bajo estn
estn cargndose
cargndose
positivamente,
positivamente, atrayendo
atrayendo a
a las
las
molculas
molculas de
de ADN
ADN con
con carga
carga negativa
negativa
y
y permitiendo
permitiendo que
que las
las protenas
protenas y
y los
los
contaminantes
contaminantes se
se eliminen
eliminen mediante
mediante
el
el lavado
lavado

Purificacin
Purificacin de
de cidos
cidos
nucleicos
nucleicos en
en base
base a
a
micro
micro esferas
esferas
magnticas
magnticas

El
El cido
cido nucleico
nucleico es
es
luego
luego eluido
eluido de
de las
las
partculas
partculas magnticas
magnticas
con
con un
un tampn
tampn de
de
elucin
elucin

3.2 Mtodos de
Extraccin de
Protenas:

Protenas:
Macromolculas mas abundantes:
Presentan gran variedad:
Cantidad
Tamao
Funcin
La clave de su variedad: Los
aminocidos.

Trabajar con Protenas:

Aislar una protena:

Una clula: Gran variedad de
protenas.
Esencial para determinar sus
propiedades y actividad.

Mtodos de separacin:
Tamao, carga, propiedades de
unin.

Trabajar con Protenas:

Clasificacin de mtodos de
extraccin de protenas:

3.2.1Cromatografa de Intercambio de
Iones:

DESCRIPCIN:
DESCRIPCIN:

Se
Se compone
compone de
de dos
dos
fases
fases
.. Fase
Fase estacionaria
estacionaria
(intercambiador
(intercambiador inico)
inico)

Fase
Fase mvil
mvil
Separa
Separa las
las protenas
protenas
basndose
basndose en
en la
la carga
carga
elctrica
elctrica de
de su
su superficie
superficie
inica,
inica, usando
usando resinas
resinas que
que
son
son modificadas
modificadas por
por grupos
grupos
qumicos
qumicos cargados
cargados
positivamente
positivamente o
o
negativamente.
negativamente.

FASES:
Fase estacionaria o intercambiador
inico:
Carga elctrica fija.
Retienen iones mviles.
Fase mvil:
Solucin acuosa: Solventes orgnicos.
Contienen especies inicas.

FUNDAMENTO:
Las molculas cargadas de la muestra:
intercambiadores inicos.
Las molculas pueden asociadas o
disociadas (unin reversible).
Intercambiadores: aninicos y
catinicos.

3.2.1 Cromatografa de Intercambio de

Iones:
INTERCAMBIADORES ANINICOS:

Portadores grupos con carga positiva.

Unen aniones de forma reversible.
Grupos amino alifticos o aromticos.
INTERCAMBIADOR CATINICO:

Portadores de grupos con carga negativa.

Unen cationes de forma reversible.
SO3, grupo carbonilo, hidroxilo fenlico.

Intercambio de Cromatografa de Iones:

Intercambio de Cromatografa de Iones:

3.2.2.

CROMATOGRAFA DE FILTRACIN

Tambin llamado de
EN GEL:

exclusin por tamao o

permeacion en gel,
separa protenas de
acuerdo con el tamao
molecular y formas y a
las molculas que no se
unen al medio
cromatografico.

Cromatografa de Filtracin de Gel:

MTODO Y MATERIAL:
Columna cilndrica
Geles utilizados:
sephadex
poliacrilamida
agarosa
Fase estacionaria:
Grnulos de material esponjoso.

Cromatografa de Filtracin de Gel:

La matriz esta formado
por un polmero
entrecruzado con poros
de tamao determinado.

Las protenas de mayor

tamao migran ms
rpido hacia la parte
inferior.

Las de menor tamao

penetran en los poros y
su marcha es mas lenta.

3.2.3 Cromatografa de Afinidad:

La
La Cromatografa
Cromatografa de
de Afinidad
Afinidad
permite
permite la
la separacin
separacin de
de
mezclas
mezclas proteicas
proteicas por
por su
su
afinidad
afinidad o
o capacidad
capacidad de
de unin
unin
a
a un
un determinado
determinado ligando.
ligando.

Las
Las protenas
protenas que
que tienen
tienen una
una
alta
alta afinidad
afinidad hacia
hacia su
su grupo
grupo
qumico
qumico especfico
especfico tales
tales como
como
los
ligandos,
se
unirn
los
ligandos,
se
unirn
covalentemente
covalentemente y
y estas
estas se
se
unirn
unirn a
a la
la matriz
matriz de
de la
la
columna,
columna, mientras
mientras las
las otra
otra
pasarn
a
pasarn
a travs
travs de
de la
la
columna.
columna.

3.2.4 Electroforesis en Gel:

Sistema Automtico de Extraccin:

Qiagen - BioRobot EZ1
Advanced

Sistema Automtico de Extraccin:

3.2.5 Southwestern Blot (Inmunoblot):

EXTRACCIN DE BIOMOLECULAS ALL-IN-ONE

PROCESO DE OBTENCIN

Aade
Aade Etanol
Etanol

AD
N

Carga
Carga en
en columna
columna
spin
spin

AR
N

Solucin
Solucin de
de
lavado
lavado de
de la
la
IE
IE

Solucin
Solucin de
de lavado
lavado A
A

Tampn
Tampn de
de
elucin
elucin F
F

Solucin
Solucin de
de elucin
elucin A
A

ADN
ADN
GENOMICO
GENOMICO

ARN
ARN
TOTALES
TOTALES

microA
microA
RN
RN

proten
proten
as
as

Carga
Carga en
en columnamicro
columnamicro
ARN
ARN

Solucin
Solucin de
de
lavado
lavado A
A
Solucin
Solucin de
de
elucin
elucin A
A

microARN
microARN

gel
gel de
de SDSSDSPAGE
PAGE
Solucin
Solucin de
de
lavado
y
elucin
lavado y elucin
C
C

PROTEINAS
PROTEINAS

Similar
Similar al
al mtodo
mtodo de
de aislamiento
aislamiento de
de un
un solo
solo paso
paso de
de
Chomczynski
Chomczynski y
y Sacchi
Sacchi (1987).
(1987).

Este
Este mtodo
mtodo implica
implica la
la lisis
lisis
de
de las
las clulas
clulas con
con
isotiocianato
isotiocianato de
de guanidina
guanidina
y
y fenol
fenol en
en una
una solucin
solucin
monofsica
monofsica

Despus
Despus de
de la
la adicin
adicin de
de
cloroformo
cloroformo donde
donde se
se
extraen
extraen el
el ADN
ADN y
y las
las
protenas,
protenas, dejando
dejando el
el ARN
ARN
en
en el
el sobrenadante
sobrenadante
acuoso.
acuoso.

Para
Para el
el aislamiento
aislamiento
simultneo
simultneo de
de RNA
RNA total
total
y
y el
el ADN
ADN de
de la
la misma
misma
muestra
muestra de
de la
la planta.
planta.

SISTEMA DE
EXTRACCIN
AUTOMATIZADA.
DEFINICION :
Es un sistema de extraccin automtico en el cual se utiliza una
instrumentacin grande, costosa y compleja diseada para el procesamiento
de muestras de alto rendimiento, esto simplifica el aislamiento de cidos
nucleicos.
REQUISITOS :
Las extracciones automatizadas deben ser ms consistente y reproducible.
La velocidad, precisin y fiabilidad de toda extraccin de proceso debe ser
mxima y al mismo tiempo minimizar el riesgo de contaminacin cruzada.
BENEFICIOS :
Reduce el tiempo de trabajo.
Disminuir la mano de obra y costos.
Aumentan la seguridad del trabajador y ofrece la oportunidad de la
reproducibilidad y la calidad de resultados.

El proceso de extraccin tarda unos 20 minutos desde el

inicio hasta el final. Se realizan los siguientes pasos :
1.-Aadir
las
1.-Aadir
las
muestras
lquidas
muestras
lquidas
del
reactivo
de
del
reactivo
de
cartucho
cartucho

2.- Colocar el
reactivo de cartucho
en la mquina

3.3.- Presionar
Presionar el
el
botn
botn Start.
Start. ADN
ADN se
se
eluir
eluir en
en un
un buffer
buffer
de
de elucin
elucin al
al final
final del
del
proceso
proceso

POSIBLES
POSIBLES DIRECCIONES
DIRECCIONES FUTURAS
FUTURAS

CONCLUSIONES

El
El ADN
ADN en
en 1869
1869 hasta
hasta la
la actualidad
actualidad se
se ha
ha desarrollado
desarrollado muchas
muchas tcnicas
tcnicas
para
para la
la purificacin
purificacin de
de biomolculas.
biomolculas.
La
La extraccin
extraccin con
con guanidinium
guanidinium se
se utiliza
utiliza ampliamente
ampliamente en
en la
la extraccin
extraccin
del
del ADN
ADN yy ARN
ARN yy purificacin
purificacin por
por cromatografa
cromatografa que
que es
es mtodo
mtodo para
para la
la
inmunotransferencia
inmunotransferencia que
que se
se utiliza
utiliza para
para extraer
extraer las
las protenas.
protenas.
La
La extraccin
extraccin de
de biomolculas
biomolculas ayudan
ayudan a
a los
los investigadores
investigadores yy cientficos
cientficos
en
en el
el anlisis
anlisis dentro
dentro de
de la
la biologa
biologa molecular.
molecular.
El
El sistema
sistema de
de extraccin
extraccin de
de cidos
cidos nucleicos
nucleicos automatizado
automatizado se
se ha
ha
desarrollado
desarrollado por
por el
el crecimiento
crecimiento de
de la
la tecnologa,
tecnologa, adems
adems de
de poseer
poseer
mltiples
mltiples beneficios
beneficios para
para la
la investigacin.
investigacin.
En
En un
un futuro
futuro se
se debe
debe implementar
implementar metodos
metodos de
de extraccin
extraccin mas
mas rpidos
rpidos ,,
porttiles
porttiles ,, eficaces
eficaces yy precisos
precisos ..

Gracias por su Atencin

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN
PRESTADA A ESTA EXPOSICIN