Anda di halaman 1dari 41

KROMATOGRAFI KOLOM

Tresna Lestari, M.Si., Apt

PENGERTIAN
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam
campuran menjadi unit-unit yang terpisah satu
dengan yang lain berdasarkan pada perbedaan
sifat masing-masing.
Perbedaan sifat : perbedaan kelarutan,
perbedaan kemampuan menyerap atau terikat
pada komponen lain, perbedaan muatan ionik,
ukuran molekul, dan lain sebagainya.

SEJARAH KROMATOGRAFI
KOLOM
chromos (zat warna) dan
graphos (gambar)

seorang botanis dari Rusia : Michael Tswett


(1906)

Zat hijau daun Karoten (kuning


oranye/pucat), feofitin (keabu-abuan, kadangkadang tidak tampak), klorofil-b (hijau tua),
klorofil-a (biru kehijauan), dan xantofil (kuning)

KROMATOGRAFI KOLOM
Merupakan kelanjutan dari KLT
Prinsip sama dengan kromatografi lapis
tipis
Digunakan untuk memurnikan senyawa
atau memisahkan campuran
Dilaksanakan dalam suatu kolom yang
diisi dengan fase diam
Fase diam : Padat, cair
Fase gerak : Cair, gas

PEMBAGIAN
KROMATOGRAFI KOLOM
Fase
Diam
Padat
Cair

Jenis
Fase
Kromatogra
Gerak
f
KK, KCV,
Cair
KCKT
Gas
KG
Cair
KCKT
Gas
KG

Rangkaian Dasar Alat


Kromatografi Kolom
Column

Istilah-istilah
Dalam Kromatografi Kolom
Fase diam (stationer phase), yaitu bahan yang
digunakan dalam kromatografi yang tidak bergerak
dan membentuk pelat-pelat teoritis.
Fase bergerak (moving phase, mobile phase), yaitu
bahan dalam kromatografi yang membawa campuran
komponen yang akan dipisahkan dan bergerak
sepanjang fase diam.
Penyangga atau matrik (support), yaiu bahan
padat yang digunakan untuk menahan fase diam
supaya tidak bergerak.

Solut (solute), adalah campuran komponenkomponen yang akan dipisahkan melalui


sistem kromatografi.
Pengembang (developer) atau eluen
(eluent), adalah pelarut yang digunakan untuk
mengelusi campuran komponen dalam sistem
kromatografi supaya dapat bergerak sepanjang
kolom.
Eluat, yaitu pengembang atau eluen yang
keluar dari dalam kolom yang mengandung
komponen-komponen yang sudah terpisahkan.

MEKANISME PEMISAHAN
Kromatograf Adsorbsi, komponen yang dipisahkan
secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben.
Kromatograf Partisi, analit mengalami partisi
antara lapisan cairan fase diam (stasioner) & eluen
sebagai fase gerak (mobile).
Kromatograf Size Eksklusi
Solut dilewatkan ke dalam adsorben berpori
Solut dengan ukuran kecil akan masuk ke dalam
pori-pori adsorben
Solut dengan ukuran lebih besar dari pori-pori
adsorben akan terelusi lebih dulu
Biasa digunakan untuk memurnikan dan
memisahkan protein

Kromatograf Pertukaran Ion, fase diam memiliki


muatan tertentu (kation atau anion), analit yang
berbeda muatannya akan tertahan dalam adsorben
dan secara selektif akan terelusi oleh fase gerak
berupa dapar dengan pH dan kekuatan ion tertentu.
Kromatograf Pasangan Ion, fase diam dapat
berupa silika yang disilanisasi (mis. C8 atau C18)
dengan fase gerak berupa buffer + kosolven organik
+ ion tanding yang muatannya berawanan dengan
molekul sampel.
Kromatograf Afnitas

Banyak digunakan untuk memisahkan enzim-enzim

Fase diam memiliki gugus khas (ligan) dengan afinitas


tinggi terhadap solut

Solut yang bentuknya cocok dengan ligan akan tertahan


di adsorben (membentuk kompleks), solut yang lain
akan terelusi

Kompleks yang terbentuk antara solut dengan ligan


dielusi ulang sehingga diperoleh solut yang diinginkan.

Gambar kromatogaf
kolom

Cara Preparasi Kolom


Cara Basah

Siapkan kolom
Masukkan glass wool
Masukkan pasir
pantai
Masukkan solvent
Silika disuspensikan
dalam solven
masukkan ke dalam
kolom
Keluarkan sisa solven
Masukkan pasir
pantai
Sample dilarutkan

Cara Kering

Siapkan kolom
Masukkan glass wool
Masukkan pasir pantai
Silika kering
dimasukkan dalam
kolom
Masukkan pasir pantai
Masukkan solvent
Sample + silika digerus
masukkan ke dalam
kolom

Di dalam kolom, aliran fase gerak akan


membawa komponen-komponen analit
ke arah sepanjang kolom
Pada saat fase gerak mengalir sepanjang
kolom akan terjadi kesetimbangan
dinamis antara komponen yang terdapat
dalam fase gerak, dengan komponen
yang terdapat dalam fase diam
jumlah pelat teori (N)

N : jumlah pelat teoritik


L : panjang kolom
H : tinggi pelat

Retensi (Tambat)
Retensi ini dinyatakan sebagai V R
(volume tambat) atau tR (waktu tambat)
Volume fase gerak yang diperlukan
untuk membawa linarut dari kolom
sampai ke detektor dinamakan volume
retensi (VR)
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa
untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut waktu retensi (tR)

Retensi diukur berdasarkan waktu


dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum.
tr A / Vr
A

Waktu/Volu
me

Untuk beberapa senyawa, waktu


retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:
Tekanan yang digunakan
(berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)
Kondisi dari fase diam (bahan dan
ukuran partikel)
Komposisi yang tepat dari pelarut
Temperatur pada kolom

Tambat Relatif
Tambat relatif () merupakan rasio tambat
antara dua linarut yang berbeda setelah
dielusi
Makin besar harga akan makin besar
selisih waktu tambat linarut 2 - waktu
tambat linarut 1.
Berarti kedua puncak linarut tersebut
dapat terpisah dengan baik.
Keadaan tersebut menggambarkan
kemampuan kolom membedakan linarut
1 dan linarut 2.

18

Puncak dan Bercak

Keterangan
Puncak pada KCKT p-dihidroksi benzen
paling lama tertahan dalam kolom
dengan fase diam silika gel. Karena
ikatannya paling kuat.
Bercak pada KLT p-dihidroksi benzen
paling pendek migrasinya, karena ikatan
dengan fase diam silika paling kuat.
Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta
dihidroksi dan o dihidroksi benzen paling
mudah terelusi oleh pelarut karena
ikatan adsorbsinya dengan silika makin
lemah.
20

Parameter Kinetika
Pemisahan

Selektifitas ()
Kapasitas kolom (k)
Resolusi (Rs)
Jumlah Pelat Teori (N)

Selektifitas/Faktor
Pemisahan ()
Yaitu kemampuan instrumen utuk
mengenali senyawa-senyawa di
dalam campuran
Untuk mendapatkan selektifitas
maksimum harus dicari mekanisme
pemisahan yang paling sesuai
(partisi, adsorpsi, size exclusion, atau
ion exchange)

Kp = Koefisien partisi, perbandingan konsentrasi


analit dalam fase diam dan fase gerak (Cs/Cm)
Pembilang adalah Kp yang lebih besar
Nilai 1
Nilai makin besar maka pemisahan makin baik

Kapasitas Kolom (k)


Ukuran kekuatan interaksi suatu
analit dengan fase diam
Menunjukkan kemampuan kolom
menampung analit.
Semakin lama analit berada dalam
kolom, akan semakin besar nilai
kapasitasnya.

Jumlah Pelat Teori (N)


Pada saat fase gerak mengalir sepanjang
kolom akan terjadi kesetimbangan
dinamis antara komponen yang terdapat
dalam fase gerak, dengan komponen
yang terdapat dalam fase diam
Proses kesetimbangan terjadi pada
banyak pelat
Makin banyak pelat pemisahan makin
baik

Dalam kromatografi kolom :


Jumlah lapisan

= Jumlah Pelat Teori (N)

Tinggi Lapisan
= Tinggi (H)/jarak yang
setara dengan pelat teori (Height
Equivalent to a Theoritical Plate = HETP)

H = tinggi pelat yang setara pelat teori


L = panjang kolom (cm)
N = jumlah pelat

Makin besar N makin kecil H kolom


makin efisien

Resolusi (Rs)
Yaitu ukuran kuantitatif yang
menyatakan kemampuan kolom
dalam memisahkan komponen2
komponen
0
1

tm
V

tr1

Vr1
Vr2

W1
tr2

W2

Rs = 1 pemisahan
tidak sempurna
Rs 1,5 pemisahan
baik

atau

d = jarak dua puncak maksimum (d


makin besar pemisahan makin baik)
WA = lebar alas puncak A
WB = lebar alas puncak B

Resolusi dipengaruhi 3 faktor yaitu :


Efisiensi (N)
Selektivitas ()
Retensi (k)

Kromatogram
Yaitu respon detektor dalam bentuk
grafik di antara sumbu respon versus
waktu retensi

Kromatogram HPLC

Kromatogram GC
Retentio
n Time

Name

6.748

-PINENE, (-)-

24.16%

7.512

2--PINENE

1.96%

11.007

TERPINEOL

1.69%

11.175

Decanal (CAS)

1.86%

13.966

Dodecanal (CAS)

17.55%

14.246

Caryophyllene

3.80%

14.581

1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3methylene-, (Z)-

1.57%

14.776

1-Dodecanol (CAS)

42.65%

16.391

Acetic acid, dodecyl ester (CAS)

4.76%

Pada kromatografi yang ideal bentuk


pita-pita kromatogram yang
diperoleh seharusnya berupa
puncak-puncak yang sangat sempit
dan terpisah satu sama lain

Penyebab Pelebaran Puncak


Difusi Eddy
Difusi Longitudinal
Efek Perpindahan Massa

Difusi Eddy
Penyebaran molekul analit dalam
kolom karena packing kolom yang
tidak seragam sehingga analit
mengambil jalan yang tidak sama
panjang

Difusi Longitudinal
Molekul-molekul sampel menyebar di dalam
pelarut tanpa adanya pengaruh luar apapun.
Contoh : gula melarut dalam air secara perlahanlahan bahkan tanpa diaduk.
Kecepatan alir fase gerak harus dipilih
sedemikian rupa sehingga difusi longitudinal
tidak mempunyai efek yang merugikan.

Efek Transfer Massa


Molekul fase diam merupakan
struktur yang berpori

Molekul sampel yang masuk ke dalam


pori akan berhenti untuk dipindahkan
dengan aliran fase gerak

Ada dua kemungkinan yang terjadi pada


molekul sampel:
Molekul sampel berdifusi balik ke aliran
fase gerak, molekul sampel keluar
bersama aliran fase gerak
meningkatkan waktu retensi
Molekul berinteraksi dengan fase diam dan
akan teradsorpsi. Untuk sementara waktu,
molekul sampel tetap menempel pada
fase diam meningkatkan waktu retensi

Interaksi Antara Fase Diam


dan Analit
(Adsorbsi Isotermik)
a. Tipe konvek, adsorpsi mula-mula terikat
dengan kuat oleh fese diam, tetapi makin
lama makin lemah sehingga bentuk
kurvanya menjadi konvek atau harga K>1
b. Tipe normal (linier), ikatan yang terjadi
pada setiap saat tetap. Sehingga berupa
garis lurus dan K = 1.
c. Tipe konkap, terjadi bila mula-mula
linarut tidak kuat interaksinya. tetapi
kemudian menjadi lebih kuat sehingga
terikat lama pada fase diam. berarti K < 1

Contoh Gambar Adsorbsi


Isotermik

Gambar:

40

TERIMAKASIH