SOUTHERN BLOTTING

DAN NORTHERN
BLOTTING
Oleh :
Kelompok VI
Almaun
(F1C1 13 044)
Andi Amalia Hamka

F1C1 13 084)
Debby Zulfitri Cahyuni

F1C1 13 012)
Fathmasari Fitrianingsih

1C1 13 058)

JURUSAN KIMIA

Wasiara
FAKULTAS
MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

(F1C1 13 090)

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI
2016

Pendahuluan
Blot/Blottin
g
Berdasarkan
Tipenya, terdiri
atas :

1
Southern
Blotting (DNA)

Pengertian

Teknik memindahkan atau mentransfer DNA,

RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks
membran. Teknik ini berupa lanjutan dari
penggunaan elektroforesis gel.

3
Northern
Blotting (RNA)

Western Blotting
(Protein)

Southern Blotting (DNA)

Southern Blotting
(DNA)
Pengertian dan
Sejarah

KomponenKomponen

Tahapan dan
Mekanisme
Kerja

Pengertian dan Sejarah Southern

Blotting (DNA)
Southern
Blotting (DNA)
Sejarah

Sebuah metode yang sering digunakan dalam

Pengertian
bidang Biologi Molekular untuk menguji
keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu
sampel DNA.

Metode ini ditemukan oleh seorang

ahli biologi dari Inggris yang
bernama Edward M. Southern,
yang mengembangkan prosedur ini
pada tahun 1975 di Universitas
Edinburgh
Edward M. Southern

Southern Blotting (DNA)

Komponen-Komponen utama pada

Southern Blotting (DNA)

Struktur Nitroselulosa

Membran
Nitroselulos
a

DNA probe

Membran Nitroselulosa
digunakan sebagai tempat hasil
jiplakan fragmen DNA dari gel
agarosa
Merupakan sutau
fragmen dna yang
berfungsi sebagai
pelacak target gen
Harus bersifat spesifik
dan komplemen
terhadap DNA target
DNA Probe

Lanjutan
Larutan
Buffer

DNA

Enzim
Retriksi

Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan

mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari
konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah)

Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada

tekhnik Southern Blotting

Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentu

Tahapan Southern Blotting

Tahap- tahap Southern Blotting

(DNA)
1

2
Isolasi DNA dan
Pemotongan DNA

Fragmentasi DNA
dengan Elektroforesis

Transfer DNA ke
Membran (Blot)

4
Hibridisasi DNA

Deteksi DNA

Isolasi DNA dan

Pemotongan DNA

EcoR I

Tahap untuk memperoleh DNA yang

akan dideteksi. Pemotongan DNA yang
ingin diperoleh dilakukan dengan
menggunakan enzim retriksi
(endonuklease retriksi) yang bersifat
spesifik terhadap DNA

EcoR I EcoR I

EcoR I

Fragmentasi DNA dengan

Elektroforesis gel

Merupakan tahap dimana Fragmen-fragmen

dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran
berat molekulnya.
Berdasarkan prinsip elektroforesis, Fragmen
DNA yang ukuran berat molekulnya lebih
kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub
negatif kekutub positif dibandingkan dengan
fragmen DNA dengan berat molekul lebih
besar.

 Proses denaturasi DNA dilakukan dengan

merendam gel dalam larutan denaturan (NaOH )

Denaturasi DNA

NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan

rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA
Ikatan hidrogen antar untai DNA yang putus
menyebabkan struktur DNA yang semula double
heliks menjadi DNA single strand

4
Transfer DNA ke Membran
nitroselulosa

DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer

ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang
disebut dengan blotting.

Tahap ini dapat dilakukan dengan 2

pilihan metode, yaitu:

Berdasarkan prinsip Kapilaritas

Berdasarkan prinsip
elektroforesis

Gel agarosa dijiplak pada

membran nitroselulosa

Merupakan salah satu metode tahapan transfer DNA ke

membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip
Kapilaritas
Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada
pembuluh, celah atau pori-pori kecil

Fragmen DNA yang telah

terjiplak pada membran
nitroselulosa kemudian
dipanaskan pada suhu 60oC
kemudian membran diberi radiasi
UV agar terbentuk ikatan kovalen
dan permanen antara pita-pita
DNA dengan membran

Hibridisasi DNA

Hibridisasi DNA adalah proses pembentukan

molekul double helix dari single strand DNA probe
dan single strand DNA target
Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa
direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss*
(diberi radioisotop)
Fragmen Single Strand
DNA

Probe yang cocok untuk

Single strand DNA

Label isotop
atau fluoroscense

Deteksi DNA

Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang

menggunakan pelacak/probe
Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa
ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.
Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat
lokasi sinyal DNA

Northern Blotting (RNA)

Northern Blotting
(RNA)
Pengertian dan
Sejarah

Tahapan dan
Mekanisme Kerja
Komponen-Komponen

Pengertian dan Sejarah Northern

Blotting (RNA)
Northern
Blotting (RNA)

Pengertian

Sejarah

Northern Blot atau RNA

Blot dikenalkan pertama kali
oleh Alwin pada tahun 1977

Secara umum teknik ini mirip dengan Southern

Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu
RNA.
Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA
berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran
menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa
komplementer untuk semua, atau sebagian, dari
urutan mRNA target

Komponen-Komponen utama pada

Northern Blotting (RNA)
Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA
dari gel agarosa formaldehid

Membran

Formaldehi
d

Probe

Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah nilon

Nilon

Probe atau RNA probe adalah fragmen

yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat
Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan basa
komplementer dari urutan mRNA target.

Tahap- tahap Northern Blotting

(RNA)
2

Isolasi RNA
3

Transfer ke membran
dan imobilisasi
5

Elektroforesis
4

Prehibridisasi dan
hibridisasi dengan probe
6

Pencucian

Deteksi

Isolasi RNA

Penghancuran dinding
sel
Lisis dilakukan
menggunakan detergen
Pengotor akibat lisis sel
dipisahkan dengan cara
sentrifugasi
Kemudian molekul
nukleotida (DNA dan
RNA) dipisahkan dari
protein menggunakan
fenol

Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap

berikut, yaitu :

Pemurnian RNA
Penghilangan protein dan
DNA
Enzim DNAase digunakan
untuk menghancurkan
DNA sehingga RNA
diisolasi secara utuh

Purifikasi RNA dapat

dilakukan dengan
mencampur larutan tersebut
dengan PCl yang berfungsi
memekatkan, memisahkan
RNA dari larutan, dan
mengendapkan.

Elektroforesis

Merupakan tahap dimana RNA

dielektroforesis menggunakan gel
agarosa formaldehida

Formaldehida

Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk
mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.

Transfer ke membran dan

imobilisasi

Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah

berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke
membran nilon
Membran nilon dengan muatan positif paling
efektif untuk digunakan dalam northern blot
karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga
memiliki afinitas tinggi.

Setelah RNA ditransfer ke membran,

maka membran harus segera disiapkan
untuk crosslink RNA dengan sinar UV
Tujuan crosslink RNA adalah untuk
membuat RNA terikat kuat di membran

Transfer buffer yang digunakan mengandung

formamida karena menurunkan suhu dari interaksi
probe-RNA yang dapat menyebabkan degradasi
RNA.

Nilon

Formamida

Prehibridisasi dan hibridisasi

dengan probe

Tujuan dilakukannya prehibridisasi sebelum

hibridisasi adalah memblok bagian
nonspecific untuk mencegah probe yang
single strand dari mengikat sembarang
bagian pada membran.

Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan

bahwa probe ini melengkapi semua atau
sebagian, dari urutan mRNA target
Probe harus diberi label baik dengan isotop
radioaktif (32P) atau dengan
chemiluminescence di mana alkali fosfatase
atau horseradish peroxidase (HRP)
memecah chemiluminescent substrat
menghasilkan emisi terdeteksi cahaya
Horseradish peroxidase (HRP)

Alkali fosfatase

Pencucian

Tujuan dari pencucian

membran adalah untuk
memastikan bahwa probe telah
terikat secara khusus dan
untuk mencegah sinyal balik
yang timbul
Hal ini juga dilakukan untuk
menghilangkan unhibridisasi
probe, dengan larutan buffer
misalnya dengan Sodium
Citrate

Sodium Citrate

Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot

disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering
kemudian membran di autoradiografi dengan X-ray

Deteksi

Tahapan deteksi dalam Northern Blot

dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu :
Radioaktivi
tas

Probe ditandai
dengan 32P (atau
33p)

Non-radioaktif

Deteksi dilakukan
dengan pewarnaan,
misalnya dengan
teknik
chemiluminescence

Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern

Blotting
Southern Blotting

Northern Blotting

Deteksi molekul

DNA (ds)

mRNA (ss)

Membran

Nitroselulosa

Nilon

Elektroforesis gel

Gel agarosa

Gel agarosa formaldehid

Perawatan gel

Pemurnian, denaturasi dan

netralisasi

Metode blotting

Transfer melalui kapiler

Transfer melalui kapiler

Probes

DNA (radioaktif dan

nonradioaktif)

cDNA, cRNA (radioaktif

dan nonradioaktif)

Sistem deteksi

Autoradiography,
Chemiluminescent
Colorimetric

Autoradiography
Chemiluminescent
Colorimetric

DANKE SCHN !!!