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ENGENHARIA BIOQUMICA

Prof. Dbora de Oliveira


Tania Maria Costa estgio docncia

debora.oliveira@ufsc.br
Mestrado em Engenharia de Alimentos
URI-Campus de Erechim

Engenharia Bioqumica
Prof. Marco Di Luccio

Microrganismos e meios para utilizao industrial

Quais as caractersticas desejveis em


microrganismos e meios de cultura para
operao em processos industriais?

Mestrado em Engenharia de Alimentos


URI-Campus de e
Erechim
Microrganismos
meios de cultivo

Engenharia Bioqumica
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Microrganismos
Principais microrganismos de interesse industrial
estudados pelos Engenheiros Qumicos

Bactrias

Leveduras

Fungos filamentosos
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Microrganismos
meios de cultivo

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Microrganismos
REGRAS DE NOMENCLATURA
Binominal: composto por Gnero e Espcie
Itlico

Saccharomyces cerevisiae
gnero

espcie

Escherichia coli

Sublinhado

Penicillium janthinellum LEB462


cepa, estirpe, linhagem
Cepa - Linhagem ou estirpe, grupo de microrganismo da mesma espcie, com caractersticas genticas
e bioqumicas distintas.

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meios de cultivo

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Bactrias
As bactrias apresentam uma morfologia simplificada, sendo a maioria em
formas comuns: cocos, bacilos e espiraladas e outras em formas especiais:
quadradas e estreladas
Espiraladas

Cocos

Bacilos

Streptococcus pneumoniae;
Neisseria meningitidis;
Micrococcus sp.

Aquaspirillium;
Treponema pallidum

E. coli;
Bacillus subtilis;
Pseudomonas aeruginosa

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Importncia das bactrias viso econmica


- Decomposio/biodegradao: atuam na reciclagem da matria,
devolvendo ao ambiente molculas e elementos qumicos reutilizveis
por outros seres vivos.
- Produo de alimentos: algumas bactrias utilizadas para produzir
iogurte, queijo, vinagre.
- Indstria farmacutica: na fabricao de antibiticos e vitaminas.
- Indstria qumica: na produo de lcool, acetona, bioplsticos.
- Gentica: com a alterao de seu DNA, pode-se fazer produtos como
insulina.
- Fixao do Nitrognio: retiram o nitrognio do ar e o fixam no solo,
servindo de alimentao para as plantas.

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Bactrias de interesse industrial


- Pseudomonas aeruginosa: tem um papel importante no ciclo do nitrognio.
Xanthomonas campestris: secretam polissacardeos resistentes ao
enzimtica.
Azotobacter: fixa N2 no simbioticamente, cresce numa variedade de carboidratos,
lcoois e cidos orgnicos.
Nocardia, Micobacterium, Corynebacterium: sintetizam gorduras.
Propionibacterium freudenreichii: utilizada na produo de vitamina B12 e cido
propinico.
Ralstonia eutropha: utilizada na sntese de polihidroxialcanoatos.
Bacillus thuringiensis israelensis: utilizada na produo de bioinseticida.
Leuconoctoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum:
responsveis pela fermentao do chucrute, picles e azeitonas.
Acetobacter aceti: utilizada na produo de vinagre.

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Fungos unicelulares
As leveduras so fungos unicelulares no-filamentosos,
caracteristicamente esfricas ou ovais.
Reproduzem-se por brotamento e formam colnias
pastosas ou cremosas.

Broto

Broto

Rhodotorula mucilaginosa
Saccharomyces cerevisae
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Fungos filamentosos
Fungos filamentosos so formados por HIFAS
HIFAS podem ser: septadas ou no septadas
O conjunto de hifas forma o miclio.

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Importncia dos Fungos viso econmica


- Decomposio/biodegradao: atuam na reciclagem da matria,
devolvendo ao ambiente molculas e elementos qumicos reutilizveis
por outros seres vivos. Importante no processo de compostagem e
biorremediao;
- Alimentao: fonte de protenas, vitaminas e aminocidos (cogumelos
comestveis). Utilizados como fermento na produo de po, vinho,
lcool, molho de soja, queijos;
- Indstria farmacutica: na fabricao de antibiticos.
Principais gneros utilizados na indstria:
Saccharomyces fermentaes alcolicas
Aspergillus produo de saqu e molho de soja
Penicillium produo de antibiticos e queijos
Mucor produo de enzimas
Rhizopus produo de enzimas

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Microrganismos
meios de cultivo

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Microrganismos
Obteno de microrganismos de interesse
Isolamento a partir de recursos naturais
Compra em colees de culturas
Mutantes naturais
Mutantes induzidos por mtodos convencionais
Microrganismos recombinantes por engenharia
gentica
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Microrganismos
Isolamento a partir de recursos naturais

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(Borra oleosa do processamento de petrleo)

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Microrganismos
Colees de culturas
491 colees em 65 pases

Principais (listagem completa em: http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html)


CCIAL - Cultures Cells for Institute Adolfo Lutz (http://ial.sp.gov.br)
CCT - Fundacao Tropical de Pesquisas e Tecnologia "Andre Tosello
(http://www.cct.org.br)
CBMAI - Brazilian Collection of Microorganisms from the Environment
and Industry (http://www.cpqba.unicamp.br/cbmai)
CCIBt - Coleo de Culturas de Algas, Cianobactrias e Fungos do
Instituto de Botnica ( http://botanica.sp.gov.br/colecao-de-culturas/)
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Microrganismos
Principais
DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH http://www.dsmz.de
CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast
Collection http://www.cbs.knaw.nl
ATCC - American Type Culture Collection (http://www.atcc.org)
NRRL - Agricultural Research Service Culture Collection
(http://nrrl.ncaur.usda.gov/)
SRRC - United States Department of Agriculture, Agricultural
Research Service (http://msa.ars.usda.gov/la/srrc/index.htm)
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Caractersticas desejveis em microrganismos


Elevada eficincia na converso do substrato em produto
Permitir o acmulo do produto no meio
No produzir substncias incompatveis com o produto
Constncia quanto ao comportamento fisiolgico
No exigir condies de processo complexas
No exigir meios de cultura caros
Permitir a rpida liberao do produto para o meio

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Meios para fermentaes industriais


Meio adequado para uma fermentao
Requer investigao detalhada
gua
Fontes de energia
Carbono

ltura
u
c
de
o
i
smo
e
i
n
m
a
um
org cionais
r
e
c
i
t
s
am
exi
utri
No rsal, cad ncias n

e
univ uas exig
s
tem

Nitrognio
Minerais
Vitaminas
Oxignio (caso seja aerbio)
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Necessidades dos meios de culturas adequados


Os elementos qumicos principais para o crescimento das
clulas so denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).
O carbono um dos elementos mais importantes para o
crescimento microbiano
Fonte de carbono:
- Compostos orgnicos (microrganismos heterotrficos):
carboidratos
lipdeos
protenas

- Dixido de carbono (microrganismos autotrficos):


a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgnicos.
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Necessidades dos meios de culturas adequados


Fonte de Nitrognio:
- elemento necessrio em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12%.
(constituinte das protenas, cidos nuclicos, etc.)
molculas orgnicas (aminocidos, peptdeos)
molculas inorgnicas (NH3, NO3-, N2)
Hidrognio:
- Principal elemento dos compostos orgnicos e de diversos inorgnicos (gua, sais
e gases).
Funo:
Manuteno do pH
Formao de ligaes de H entre molculas
Fonte de energia nas reaes de oxi-reduo na respirao
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Necessidades dos meios de culturas adequados


Oxignio:
- Elemento comum encontrado nas molculas biolgicas (aminocidos, nucleotdeos,
glicerdeos). Obtido a partir das protenas e gorduras.
Na forma de oxignio molecular (O2), requerido por muitos para os processos de
gerao de energia.
gua:
- Componente absolutamente indispensvel (No laboratrio se utiliza gua
destilada, filtrada e deionizada).
Outros aditivos:
Funo de aumentar a converso, evitar precipitao de ons, controlar a espuma,
provocar inibio, estabilizar o pH.

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Necessidades dos meios de culturas adequados


Outros macronutrientes:
P Sntese de cidos nuclicos, ATP
S Estabilidade de aminocidos, componente de vitaminas
K Atividade de enzimas
Mg Estabilidade dos ribossomos
Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endsporos
Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.

Bactrias

haloflicas extremas no crescem com menos de 15% de sal.


Fe Papel-chave na respirao, componente dos citocromos e das
protenas envolvidas no transporte de eltrons.

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meios de cultivo

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Meios para fermentaes industriais


Pequena Escala
Simples se definir um meio
A partir de componentes puros
Na maioria das vezes no adequado para fermentao
industrial (larga escala)
$$$$$

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Meios para fermentaes industriais


Larga escala
O meio deve atender ao mximo os seguintes critrios:
Mximo rendimento de produto/grama de substrato utilizado
Mxima concentrao de produto ou biomassa
Mxima taxa de formao de produto

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Meios para fermentaes industriais


Larga escala
O meio deve atender aos seguintes critrios:
Rendimento mnimo em produtos indesejados
Ter qualidade e prontamente disponvel durante o ano todo
Ter poucos problemas durante o preparo e esterilizao
Causar poucos problemas quanto aerao, agitao, extrao,
purificao e tratamento de efluentes

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Meios para fermentaes industriais


Exemplos de substratos muito usados
Fontes de carbono
Melao de cana
Melao de beterraba
Gros de cereais
Amido
Glicose
Sacarose
Lactose

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Meios para fermentaes industriais

Exemplos de substratos muito usados


Fontes de nitrognio
Sais de amnio
Uria
Nitratos
Farelo de soja
Resduos de abatedouro
Resduos de fermentaes
Vantagens
$

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Meios para fermentaes industriais


Outras consideraes
Outros substratos mais $$$ podem ser usados
Custo global do processo deve ser vantajoso
Procedimentos mais simples (recuperao e purificao p. ex.)
Produtos mais nobres (e $$$$)
Meios de manuteno e de produo

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Meios para fermentaes industriais


Outras consideraes
A escolha do meio tambm pode afetar o projeto do biorreator
diferentes tipos de fermentador exigem mudana do meio
Para se adequar mudanas na produtividade

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Meios para fermentaes industriais


Outras consideraes
O escalonamento tambm pode afetar o meio
Um meio de laboratrio pode no ser adequado para um
fermentador grande com baixa eficincia de transferncia
gs-lquido
Meios com alta viscosidade necessitam de um maior gasto
de energia para agitao

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Meios para fermentaes industriais


Outras consideraes
O meio pode ainda influenciar
A variao de pH
Formao de espuma
Potenciais de oxirreduo
Morfologia do microrganismo
Necessidade de adio de precursores ou inibidores
O tratamento de efluentes

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Meios para fermentaes industriais

Outras consideraes
Historicamente meios complexos indefinidos so mais usados por serem
mais baratos
Desvantagens
Variao de qualidade e rendimento do produto final devido
grande variao de composio do meio e presena de impurezas
Rendimentos imprevisveis
Problemas na recuperao do produto
Problemas no tratamento de efluentes

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Formulao de meios
Estgio essencial no desenvolvimento de processos
fermentativos em escala de laboratrio, piloto e
industrial
Meio deve satisfazer
Necessidades para gerao de biomassa
Necessidades para gerao de metablitos
Necessidades de energia
Necessidades de manuteno celular

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Formulao de meios
Equao do balano elementar
Fonte de C
+ Fonte de N + O2 +
Fonte de E
outros

Biomassa + produtos +
CO2 +
H2O + calor
Conhecimento da composio elementar dos MOs
Pode ser fundamental para a determinao da composio de um
meio
Informao nem sempre disponvel recorre-se literatura
Alguns nutrientes so frequentemente adicionados em excesso
Ateno aos fatores de crescimento

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Formulao de meios Composio elementar (Aiba, 1973)


Elemento

Bactrias

Leveduras

Fungos

50 53

45 50

40 63

nd

12 15

7,5 11

7 10

23

0,8 2,6

0,4 4,5

0,2 1,0

0,01 0,24

0,1 0,5

1,0 4,5

14

0,2 2,5

Na

0,5 1,0

0,01 0,1

0,02 0,5

Ca

0,01 1,1

0,1 0,3

0,1 1,4

Mg

0,1 0,5

0,1 0,5

0,1 0,5

Cl

0,5

Fe

0,02 0,2

0,01 0,5

0,1 0,2

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Condies ambientais

Temperatura
Oxignio
pH
Presso osmtica (concentrao de sal),
atmosfrica
Radiao

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Condies ambientais
Temperatura
Grupos

1. Psicrfilos temperatura tima abaixo


de 15 oC, suscetveis de crescer a 0 oC.
2. Mesfilos temperatura tima 20o - 40
o

C, maioria dos patgenos humanos.

3. Termfilos temperatura tima acima


de 45 oC.

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Condies ambientais
pH:
- refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma soluo;
- maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 7,5);
- poucas bactrias so capazes de crescer em pH cido (como pH 4,0)
Bactrias: faixa entre pH 7,0
Excees:
- Bactrias acidfilas: alto grau de tolerncia acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0
com timo entre 2 e 3,5)
- Bactrias alcaliflicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 11).
Fungos - tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).

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Condies ambientais

Presso osmtica
No devem existir grandes diferenas na
concentrao de solutos dentro e fora da
clula, pois podem desidratar-se ou romper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de


teores de sais mais elevados.

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Medidas do crescimento microbiano


Podem ser realizadas pelos seguintes mtodos:
1) Peso seco total das prprias clulas
filtrao, secagem e pesagem
2) Peso de algum componente celular
extrao, secagem e pesagem
3) Variao no nmero de clulas
a) contagem de clulas totais (direta)
b) contagem de clulas viveis (indireta)

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Medidas do crescimento microbiano


Contagem de clulas por microscopia
Contagem do nmero total de indivduos
Contagem em cmaras a partir de diluies de uma suspenso:
Cmara de Neubauer

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Medidas do crescimento microbiano


Cmara de Neubauer

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Aumento de 100 x

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Aumento de
400 x
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Medidas do crescimento microbiano


Contagem de clulas
Contagem de clulas por colorao (clulas viveis e no viveis)

Colorao com azul de metileno


para evidenciar clulas viveis de
leveduras:
clulas azuis esto mortas;
clulas sem colorao so clulas
vivas
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Medidas do crescimento microbiano


Contagem microscpica direta
Utilizam-se cmaras especiais de contagem (lmina com grade quadriculada)
Ex.: Cmara de Petroff-Haussen (para bactrias)

Vantagens: mtodo rpido e fcil

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Medidas do crescimento microbiano


-MTODO DE ESPALHAMENTO EM
PLACA

Diluio das suspenses celulares


Amostras concentradas precisam ser diludas
So empregadas vrias diluies
decimais porque difcil prever o
nmero de viveis.
contada a placa com 30 a 300
colnias
Clculo:
n de colnias na placa x ndice de
diluio da amostra = n de
bactrias/mL
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Medidas do crescimento microbiano


Contagem das colnias formadas em meio de cultura em placas bactrias e leveduras.

Contagem de clulas vivas, no entanto um mtodo demorado,


impreciso
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Medidas do crescimento microbiano


Contagem de bactrias pelo mtodo da filtrao

Membrana filtrante colocada sobre o


meio de cultura e a placa foi incubada
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Medidas do crescimento microbiano


Determinao do peso seco
a) Amostra da suspenso centrifugada
b) Sobrenadante descartado
c) Sedimento celular lavado algumas vezes com gua
destilada ou soluo salina
d) Sedimento colocado em vidro relgio e seco em
estufa at peso constante
Aplica-se mais a fungos filamentosos ou amostras contendo
grandes densidades celulares
No pode ser aplicado quando o meio contm partculas slidas
em suspenso
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Medidas do crescimento microbiano


Determinao qumica de componentes
Celulares
a) Determina-se a massa celular pela dosagem de componentes
celulares como protena e cidos nuclicos
Pode ser usado com amostras contendo pouca densidade celular
Composio qumica das clulas pode mudar em funo do meio
de crescimento

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Medidas do crescimento microbiano outros mtodos


Turbidimetria aplica-se para bactrias e leveduras
As clulas dispersam a luz e quanto mais clulas mais turvo o meio
Pode ser medida com um espectrofotmetro

Quanto > o n. de bactrias < a quantidade de luz que transmitida

O uso da turbidimetria exige a construo de uma curva padro


Turbidez X quantidade de clulas
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meios de cultivo

Sofre interferncia de material


particulado no meio de cultura
Mtodo qualitativo Engenharia Bioqumica
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Medidas do crescimento microbiano outros mtodos


Contagem eletrnica

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Sucesso de um processo fermentativo


Microrganismo
Meio de cultura
Forma de conduo do processo
Recuperao do produto
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