Engenharia Bioquímica - Aula 02 - Microrganismos e Meios

ENGENHARIA BIOQUMICA
Prof. Dbora de Oliveira

Tania Maria Costa estgio docncia
debora.oliveira@ufsc.br
Mestrado em Engenharia de Alimentos
URI-Campus de Erechim
Engenharia Bioqumica
Prof. Marco Di Luccio
Microrganismos e meios para utilizao industrial
Quais as caractersticas desejveis em

microrganismos e meios de cultura para
operao em processos industriais?

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Microrganismos
meios de cultivo
Microrganismos
Principais microrganismos de interesse industrial
estudados pelos Engenheiros Qumicos
Bactrias
Leveduras
Fungos filamentosos
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Microrganismos
meios de cultivo
Microrganismos
REGRAS DE NOMENCLATURA
Binominal: composto por Gnero e Espcie
Itlico
Saccharomyces cerevisiae
gnero
espcie
Escherichia coli
Sublinhado
Penicillium janthinellum LEB462

cepa, estirpe, linhagem
Cepa - Linhagem ou estirpe, grupo de microrganismo da mesma espcie, com caractersticas genticas
e bioqumicas distintas.

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Microrganismos
meios de cultivo
Bactrias
As bactrias apresentam uma morfologia simplificada, sendo a maioria em
formas comuns: cocos, bacilos e espiraladas e outras em formas especiais:
quadradas e estreladas
Espiraladas
Cocos
Bacilos
Streptococcus pneumoniae;
Neisseria meningitidis;
Micrococcus sp.
Aquaspirillium;
Treponema pallidum
E. coli;
Bacillus subtilis;
Pseudomonas aeruginosa

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Microrganismos
meios de cultivo
Importncia das bactrias viso econmica

- Decomposio/biodegradao: atuam na reciclagem da matria,
devolvendo ao ambiente molculas e elementos qumicos reutilizveis
por outros seres vivos.
- Produo de alimentos: algumas bactrias utilizadas para produzir
iogurte, queijo, vinagre.
- Indstria farmacutica: na fabricao de antibiticos e vitaminas.
- Indstria qumica: na produo de lcool, acetona, bioplsticos.
- Gentica: com a alterao de seu DNA, pode-se fazer produtos como
insulina.
- Fixao do Nitrognio: retiram o nitrognio do ar e o fixam no solo,
servindo de alimentao para as plantas.

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Microrganismos
meios de cultivo
Bactrias de interesse industrial

- Pseudomonas aeruginosa: tem um papel importante no ciclo do nitrognio.
Xanthomonas campestris: secretam polissacardeos resistentes ao
enzimtica.
Azotobacter: fixa N2 no simbioticamente, cresce numa variedade de carboidratos,
lcoois e cidos orgnicos.
Nocardia, Micobacterium, Corynebacterium: sintetizam gorduras.
Propionibacterium freudenreichii: utilizada na produo de vitamina B12 e cido
propinico.
Ralstonia eutropha: utilizada na sntese de polihidroxialcanoatos.
Bacillus thuringiensis israelensis: utilizada na produo de bioinseticida.
Leuconoctoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum:
responsveis pela fermentao do chucrute, picles e azeitonas.
Acetobacter aceti: utilizada na produo de vinagre.

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Microrganismos
meios de cultivo
Fungos unicelulares
As leveduras so fungos unicelulares no-filamentosos,
caracteristicamente esfricas ou ovais.
Reproduzem-se por brotamento e formam colnias
pastosas ou cremosas.
Broto
Broto
Rhodotorula mucilaginosa
Saccharomyces cerevisae
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Microrganismos
meios de cultivo
Fungos filamentosos
Fungos filamentosos so formados por HIFAS
HIFAS podem ser: septadas ou no septadas
O conjunto de hifas forma o miclio.

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meios de cultivo
Importncia dos Fungos viso econmica

- Decomposio/biodegradao: atuam na reciclagem da matria,
devolvendo ao ambiente molculas e elementos qumicos reutilizveis
por outros seres vivos. Importante no processo de compostagem e
biorremediao;
- Alimentao: fonte de protenas, vitaminas e aminocidos (cogumelos
comestveis). Utilizados como fermento na produo de po, vinho,
lcool, molho de soja, queijos;
- Indstria farmacutica: na fabricao de antibiticos.
Principais gneros utilizados na indstria:
Saccharomyces fermentaes alcolicas
Aspergillus produo de saqu e molho de soja
Penicillium produo de antibiticos e queijos
Mucor produo de enzimas
Rhizopus produo de enzimas

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Microrganismos
meios de cultivo
Microrganismos
Obteno de microrganismos de interesse
Isolamento a partir de recursos naturais
Compra em colees de culturas
Mutantes naturais
Mutantes induzidos por mtodos convencionais
Microrganismos recombinantes por engenharia
gentica
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meios de cultivo
Microrganismos
Isolamento a partir de recursos naturais

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Microrganismos
meios de cultivo
(Borra oleosa do processamento de petrleo)
Microrganismos
Colees de culturas
491 colees em 65 pases
Principais (listagem completa em: http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html)

CCIAL - Cultures Cells for Institute Adolfo Lutz (http://ial.sp.gov.br)
CCT - Fundacao Tropical de Pesquisas e Tecnologia "Andre Tosello
(http://www.cct.org.br)
CBMAI - Brazilian Collection of Microorganisms from the Environment
and Industry (http://www.cpqba.unicamp.br/cbmai)
CCIBt - Coleo de Culturas de Algas, Cianobactrias e Fungos do
Instituto de Botnica ( http://botanica.sp.gov.br/colecao-de-culturas/)
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Microrganismos
Principais
DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH http://www.dsmz.de
CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast
Collection http://www.cbs.knaw.nl
ATCC - American Type Culture Collection (http://www.atcc.org)
NRRL - Agricultural Research Service Culture Collection
(http://nrrl.ncaur.usda.gov/)
SRRC - United States Department of Agriculture, Agricultural
Research Service (http://msa.ars.usda.gov/la/srrc/index.htm)
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Microrganismos
meios de cultivo
Caractersticas desejveis em microrganismos

Elevada eficincia na converso do substrato em produto
Permitir o acmulo do produto no meio
No produzir substncias incompatveis com o produto
Constncia quanto ao comportamento fisiolgico
No exigir condies de processo complexas
No exigir meios de cultura caros
Permitir a rpida liberao do produto para o meio

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meios de cultivo
Meios para fermentaes industriais

Meio adequado para uma fermentao
Requer investigao detalhada
gua
Fontes de energia
Carbono
ltura
u
c
de
o
i
smo
e
i
n
m
a
um
org cionais
r
e
c
i
t
s
am
exi
utri
No rsal, cad ncias n
e
univ uas exig
s
tem
Nitrognio
Minerais
Vitaminas
Oxignio (caso seja aerbio)
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Microrganismos
meios de cultivo
Necessidades dos meios de culturas adequados

Os elementos qumicos principais para o crescimento das
clulas so denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).
O carbono um dos elementos mais importantes para o
crescimento microbiano
Fonte de carbono:
- Compostos orgnicos (microrganismos heterotrficos):
carboidratos
lipdeos
protenas
- Dixido de carbono (microrganismos autotrficos):

a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgnicos.
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meios de cultivo

Fonte de Nitrognio:
- elemento necessrio em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12%.
(constituinte das protenas, cidos nuclicos, etc.)
molculas orgnicas (aminocidos, peptdeos)
molculas inorgnicas (NH3, NO3-, N2)
Hidrognio:
- Principal elemento dos compostos orgnicos e de diversos inorgnicos (gua, sais
e gases).
Funo:
Manuteno do pH
Formao de ligaes de H entre molculas
Fonte de energia nas reaes de oxi-reduo na respirao
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meios de cultivo

Oxignio:
- Elemento comum encontrado nas molculas biolgicas (aminocidos, nucleotdeos,
glicerdeos). Obtido a partir das protenas e gorduras.
Na forma de oxignio molecular (O2), requerido por muitos para os processos de
gerao de energia.
gua:
- Componente absolutamente indispensvel (No laboratrio se utiliza gua
destilada, filtrada e deionizada).
Outros aditivos:
Funo de aumentar a converso, evitar precipitao de ons, controlar a espuma,
provocar inibio, estabilizar o pH.

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meios de cultivo

Outros macronutrientes:
P Sntese de cidos nuclicos, ATP
S Estabilidade de aminocidos, componente de vitaminas
K Atividade de enzimas
Mg Estabilidade dos ribossomos
Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endsporos
Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.
Bactrias
haloflicas extremas no crescem com menos de 15% de sal.

Fe Papel-chave na respirao, componente dos citocromos e das
protenas envolvidas no transporte de eltrons.

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meios de cultivo

Pequena Escala
Simples se definir um meio
A partir de componentes puros
Na maioria das vezes no adequado para fermentao
industrial (larga escala)
$$$$$

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meios de cultivo

Larga escala
O meio deve atender ao mximo os seguintes critrios:
Mximo rendimento de produto/grama de substrato utilizado
Mxima concentrao de produto ou biomassa
Mxima taxa de formao de produto

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Larga escala
O meio deve atender aos seguintes critrios:
Rendimento mnimo em produtos indesejados
Ter qualidade e prontamente disponvel durante o ano todo
Ter poucos problemas durante o preparo e esterilizao
Causar poucos problemas quanto aerao, agitao, extrao,
purificao e tratamento de efluentes

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meios de cultivo

Exemplos de substratos muito usados
Fontes de carbono
Melao de cana
Melao de beterraba
Gros de cereais
Amido
Glicose
Sacarose
Lactose

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Exemplos de substratos muito usados

Fontes de nitrognio
Sais de amnio
Uria
Nitratos
Farelo de soja
Resduos de abatedouro
Resduos de fermentaes
Vantagens
$

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Outras consideraes
Outros substratos mais $$$ podem ser usados
Custo global do processo deve ser vantajoso
Procedimentos mais simples (recuperao e purificao p. ex.)
Produtos mais nobres (e $$$$)
Meios de manuteno e de produo

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Outras consideraes
A escolha do meio tambm pode afetar o projeto do biorreator
diferentes tipos de fermentador exigem mudana do meio
Para se adequar mudanas na produtividade

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Outras consideraes
O escalonamento tambm pode afetar o meio
Um meio de laboratrio pode no ser adequado para um
fermentador grande com baixa eficincia de transferncia
gs-lquido
Meios com alta viscosidade necessitam de um maior gasto
de energia para agitao

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Outras consideraes
O meio pode ainda influenciar
A variao de pH
Formao de espuma
Potenciais de oxirreduo
Morfologia do microrganismo
Necessidade de adio de precursores ou inibidores
O tratamento de efluentes

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Outras consideraes
Historicamente meios complexos indefinidos so mais usados por serem
mais baratos
Desvantagens
Variao de qualidade e rendimento do produto final devido
grande variao de composio do meio e presena de impurezas
Rendimentos imprevisveis
Problemas na recuperao do produto
Problemas no tratamento de efluentes

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meios de cultivo
Formulao de meios
Estgio essencial no desenvolvimento de processos
fermentativos em escala de laboratrio, piloto e
industrial
Meio deve satisfazer
Necessidades para gerao de biomassa
Necessidades para gerao de metablitos
Necessidades de energia
Necessidades de manuteno celular

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meios de cultivo
Formulao de meios
Equao do balano elementar
Fonte de C
+ Fonte de N + O2 +
Fonte de E
outros
Biomassa + produtos +
CO2 +
H2O + calor
Conhecimento da composio elementar dos MOs
Pode ser fundamental para a determinao da composio de um
meio
Informao nem sempre disponvel recorre-se literatura
Alguns nutrientes so frequentemente adicionados em excesso
Ateno aos fatores de crescimento

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Formulao de meios Composio elementar (Aiba, 1973)

Elemento
Bactrias
Leveduras
Fungos
50 53
45 50
40 63
nd
12 15
7,5 11
7 10
23
0,8 2,6
0,4 4,5
0,2 1,0
0,01 0,24
0,1 0,5
1,0 4,5
14
0,2 2,5
Na
0,5 1,0
0,01 0,1
0,02 0,5
Ca
0,01 1,1
0,1 0,3
0,1 1,4
Mg
0,1 0,5
0,1 0,5
0,1 0,5
Cl
0,5
Fe
0,02 0,2
0,01 0,5
0,1 0,2

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Condies ambientais
Temperatura
Oxignio
pH
Presso osmtica (concentrao de sal),
atmosfrica
Radiao

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Condies ambientais
Temperatura
Grupos
1. Psicrfilos temperatura tima abaixo

de 15 oC, suscetveis de crescer a 0 oC.
2. Mesfilos temperatura tima 20o - 40
o
C, maioria dos patgenos humanos.
3. Termfilos temperatura tima acima

de 45 oC.

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Condies ambientais
pH:
- refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma soluo;
- maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 7,5);
- poucas bactrias so capazes de crescer em pH cido (como pH 4,0)
Bactrias: faixa entre pH 7,0
Excees:
- Bactrias acidfilas: alto grau de tolerncia acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0
com timo entre 2 e 3,5)
- Bactrias alcaliflicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 11).
Fungos - tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).

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Condies ambientais
Presso osmtica
No devem existir grandes diferenas na
concentrao de solutos dentro e fora da
clula, pois podem desidratar-se ou romper-se.
Ex: microrganismos marinhos necessitam de

teores de sais mais elevados.

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Medidas do crescimento microbiano

Podem ser realizadas pelos seguintes mtodos:
1) Peso seco total das prprias clulas
filtrao, secagem e pesagem
2) Peso de algum componente celular
extrao, secagem e pesagem
3) Variao no nmero de clulas
a) contagem de clulas totais (direta)
b) contagem de clulas viveis (indireta)

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Contagem de clulas por microscopia
Contagem do nmero total de indivduos
Contagem em cmaras a partir de diluies de uma suspenso:
Cmara de Neubauer

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Cmara de Neubauer

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Aumento de 100 x
Aumento de
400 x

Contagem de clulas
Contagem de clulas por colorao (clulas viveis e no viveis)
Colorao com azul de metileno

para evidenciar clulas viveis de
leveduras:
clulas azuis esto mortas;
clulas sem colorao so clulas
vivas
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Contagem microscpica direta
Utilizam-se cmaras especiais de contagem (lmina com grade quadriculada)
Ex.: Cmara de Petroff-Haussen (para bactrias)
Vantagens: mtodo rpido e fcil

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-MTODO DE ESPALHAMENTO EM
PLACA
Diluio das suspenses celulares

Amostras concentradas precisam ser diludas
So empregadas vrias diluies
decimais porque difcil prever o
nmero de viveis.
contada a placa com 30 a 300
colnias
Clculo:
n de colnias na placa x ndice de
diluio da amostra = n de
bactrias/mL
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Contagem das colnias formadas em meio de cultura em placas bactrias e leveduras.
Contagem de clulas vivas, no entanto um mtodo demorado,

impreciso
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Contagem de bactrias pelo mtodo da filtrao
Membrana filtrante colocada sobre o

meio de cultura e a placa foi incubada
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Determinao do peso seco
a) Amostra da suspenso centrifugada
b) Sobrenadante descartado
c) Sedimento celular lavado algumas vezes com gua
destilada ou soluo salina
d) Sedimento colocado em vidro relgio e seco em
estufa at peso constante
Aplica-se mais a fungos filamentosos ou amostras contendo
grandes densidades celulares
No pode ser aplicado quando o meio contm partculas slidas
em suspenso
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Determinao qumica de componentes
Celulares
a) Determina-se a massa celular pela dosagem de componentes
celulares como protena e cidos nuclicos
Pode ser usado com amostras contendo pouca densidade celular
Composio qumica das clulas pode mudar em funo do meio
de crescimento

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Medidas do crescimento microbiano outros mtodos

Turbidimetria aplica-se para bactrias e leveduras
As clulas dispersam a luz e quanto mais clulas mais turvo o meio
Pode ser medida com um espectrofotmetro
Quanto > o n. de bactrias < a quantidade de luz que transmitida
O uso da turbidimetria exige a construo de uma curva padro

Turbidez X quantidade de clulas
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Sofre interferncia de material

particulado no meio de cultura
Mtodo qualitativo Engenharia Bioqumica
Medidas do crescimento microbiano outros mtodos

Contagem eletrnica

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Sucesso de um processo fermentativo

Microrganismo
Meio de cultura
Forma de conduo do processo
Recuperao do produto
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Importncia das bactrias viso econmica

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Importncia dos Fungos viso econmica

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Caractersticas desejveis em microrganismos

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Necessidades dos meios de culturas adequados

- Dixido de carbono (microrganismos autotrficos):

Necessidades dos meios de culturas adequados

Necessidades dos meios de culturas adequados

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Necessidades dos meios de culturas adequados

haloflicas extremas no crescem com menos de 15% de sal.

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Formulao de meios Composio elementar (Aiba, 1973)

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1. Psicrfilos temperatura tima abaixo

C, maioria dos patgenos humanos.

3. Termfilos temperatura tima acima

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