Metabolomics: back

to basics

Introduction
Dalam beberapa tahun terakhir telah berkembang
pesat metabolomik sebagai alat penting dalam
genomik fungsional. Banyak ulasan telah diterbitkan
tentang teknologi dan aplikasinya.
Terdapat banyak hasil eksperimen yang dipublish
setiap harinya yang belum tentu benar karena
intepretasi hasil yang salah.
Jurnal ini akan membahas metode analisis yang
berbeda, dan mendiskusikan penyimpanan data,
fase preanalytical darianalisis metabolome sebagai
ekstraksi dan preparasi sampel

Analytical methods
NMRspektrometr
i

MSn

HPLC atau
TLC-UV,

GC-MS dan
LC-MS

Umumnya
digunakan

MS
(Mass spectroscopy)

GC-MS (Gas
Chromatography-Mas
Spectroscopy)

LC-MS (Liquid
Chromatography-Mas
Spectroscopy)

menunjukkan
sensitivitas tinggi dan
resolusi
Struktur yang kompleks
tertentu seperti metabolit
sekunder, misalnya glikosida,
tidak dapat dianalisis dengan
kromatografi gas.
kisaran kecil
polaritas dan berat
molekulmetabolit yang
dapat
dianalisis dengan GC.

Kurangnya database
sehingga harus
diidentifiksi manual

NMR
(Nuclear Magnetic
Resonance
spectroscopy)
Pelengkap
metode
analisi lain
memiliki
beberapa
keunggulan
daripada
kromatografi
dan metode
dalam MS

Analisisnya berlangsung
cepat dan rinci

Membutuhakan sedikit
preparasi sample

NMR adalah detektor

universal di mana sinyal
memberikan
informasi langsung
tentang struktur kimia
Data dapt digunakan
dalam jangka waktu
lama, dengan syarat
ekstraksi memliki
prosedur dan pelarut
yang digunakan sama

Quantitative analysis
MS sensitifitas baik
membutuhakan kurva kalibrasi setiap senyawa
kurva kalibrasi untuk ratusan sinyal, banyak yang
bahkan belum teridentifikasi
hanya mengukur nilai relatif untuk masing-masing
senyawa yang terdeteksi, misalnya persentase
kenaikan atau menurun
NMR intensitas sinyal hanya tergantung dari
konsentrasi molar dalam larutan
tidak ada kurva kalibrasi diperlukan untuk semua
senyawa individu
sensitivitas rendah.

Identification of compounds
NMR-spektrometri adalah metode yang
memberikan karakter unik pada setiap senyawa
tunggal. Informasi dari 1H, 13C dan berbagai
spektrum 2D-NMR memungkinkan Penjelasan
struktur lengkap senyawa. Semua spektroskopi
lainnya metode hanya memberikan informasi
parsial struktural elemen, namun tidak memberi
informasi mengenai setiap atom tunggal seperti di
NMR, dan akibatnya hanya dapat digunakan untuk
penjelasan struktur parsial, atau untuk identifikasi
senyawa yang dikenal.

Long-term data storage

Metabolomik tidak memiliki database dengan nilai jangka
panjang belum. Satu dari masalah utama adalah
reproduktifitas dari metode analisis, dan sinyal yang tidak
diketahui pada kromatogram dan spektrum.
NMR-spektroskopi memiliki keuntungan yaitu adalah satusatunya metode di mana Karakteristik fisik senyawa akan
selalu sama. Hal ini membuat 1H NMR menjadi metode pilihan
untuk analisis.
Kesulitan dalam membuat database metabolomic dapat
tergambarkan oleh fakta bahwa setelah 40 tahun GC (-MS)
dan MS dan 30 tahun HPLC masih belum ada database yang
tersedia yang mencakup semua produk alami.

Preanalytical procedures
1st

Pemanenan

Problem

Berbeda cara dan

waktu, metabolit
berbeda
Perubahan
metabolisme

2nd

isolasi metabolit

Sifat senyawa
dalam tanaman

Polar
Semi Polar
Non-Polar

Extraction solvents
Dalam ekstraksi membutuhkan solvent, dalam
pemilihan solvent harus mempertimbangkan:
- Selektivitas pelarut
- Polaritas (figure 1)

- Titik didih (figure 2)

- Tingkat toksisitas dan lingkungan

pertimbangan
- Kemungkinan gangguan pada
prosedur analitis
- Kemungkinan Kontaminasi yang
dapat menyebabkan artefak

 Kemungkinan kontaminasi dalam

pelarut yang mungkin mengganggu
analisis

Masalah lain di metabolomik NMR

berbasis
berasal dari pertukaran hidrogen OH,
NH, atau SH dengan pelarut deuterasi
seperti air atau alkohol. (fig 7)

menunjukkan bahwa penyimpanan untuk beberapa

waktu mengurangi intensitas sinyal H-6 dan H-8 dalam
spektrum 1H-NMR

Di bidang metabolomik tidak ada metode

yang sempurna untuk mengekstrak semua
metabolit tanpa formasi artefak dan
degradasi kimia. Untuk meminimalkan
masalah metode ekstraksi terdapat dua
metode sederhana yaitu:
1. metode ekstraksi Dua-tahap untuk
analisis NMR
2. metode ekstraksi pelarut tunggal untuk
NMR

Metabolomics in dynamic
system
Salisilat (SA) diproduksi dalam
jumlahkecil karena merupakan
senyawa sinyal untuk perlawanan.
Pada biosintetsi salisilat menunjukan
Catharanthus kultur sel roseus
menghasilkan Asam 2,3Dihydroxybenzoic (DHBA)

Dalam studi retrobiosynthetic bahwa DHBA di C. roseus

berasal dari jalur isochorismate ini dan langkah pertama adalah
pengkodean gen, synthase isochorismate (ICS) dikloning dari C.
roseus. Baru percobaan induksi dengan garis sel baru C. roseus
dengan glukosa 1-13C-labeled. menunjukkan bahwa Pola 13Clabeled SA ini sejalan dengan isochorismate pathway.
Namun, persentase label di SA dan DHBA yang diisolasi 24
jam setelah penginduksian berbeda. Pada t = 0, titik waktu
dimana sel diinduksi dengan Pythium phanidermatum, baik SA
dan DHBA berada di bawah batas deteksi. Sebagai kegiatan ICS
diinduksi, kesimpulan yang dapat ditarik bahwa kedua senyawa
yang berasal dari jalur yang sama. Tapi label yang berbeda
berarti bahwa ada proses yang lebih kompleks.
Dengan kata lain, SA mungkin dibentuk oleh enzimatik yang
telah ada, sedangkan DHBA adalah hasil dari jalur yang
diinduksi pada tingkat gen. Maka perlu mempelajari sistem
pertahanan tanaman lebih mendalam.

Conclusions and
Perspectives