KROMATOGRAFI

DAN ELEKTROFORESIS
Prof. Dr. Slamet Ibrahim
S.DEA. Apt.
Dr. M. Insanu MSi.
Dr. Benny Permana MSi.

Satuan Acara Perkuliahan

1. Pendahuluan
2. Konsep Dasar, Definisi dan Istilah
3. Teori Kromatografi
4. Aplikasi Kromatografi
5. Kromatografi Kolom Klasik
6. Kromatografi Planar (Kertas dan Lapis Tipis)
7. Kromatografi Gas
8. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
9. Elektroforesis Kapiler
10.Aplikasi Elektroforesis Kapiler.

Pendahuluan
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang
pertama kali diperkenalkan oleh Mikhail Tswett (1906) yang
memisahkan pigmen tumbuhan (klorofil, xantofil, dll.) melalui
kolom kaca yang berisi kalsium karbonat CaCO 3
Dalam kolom kaca tersebut terbentuk zona-zona berwarna
yang terpisah akibat elusi pelarut organik yang digunakan.
Teknik pemisahan tersebut diberi nama oleh M. Tswett
sebagai Kromatografi (chroma = warna, graphien =
citra/gambaran).
Walaupun sekarang hasil pemisahannya tidak berwarna lagi
( dalam bentuk bercak ataupun grafik) teknik pemisahan ini
tetap dinamakan sebagai kromatografi.

Kromatografi Kolom Tswett

Definisi
Kromatografi adalah metode digunakan untuk pemisahan
komponen dari suatu sampel pada mana komponen akan
terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.
Fase diam mungkin berupa padat atau cair yang terikat
pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat berupa
terkemas dalam kolom, tersebar sebagai suatu lapisan,
atau terdistribusi sebagai lapisan film.
Fase gerak dapat berupa gas atau cairan yang mengalir
atau berpindah dengan arah tertentu (Pure & Applied
Chem, 37, 447, 1974)

 Kromatografi merupakan prosedur pemisahan zat terlarut

oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam
sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam
arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas yang disebabkan adanya perbedaan
dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran
molekul atau kerapatan muatan ion, dengan demikian
masing-masing zat tersebut dapat diidentifikasi atau
ditetapkan dengan suatu metode analitik (Farmakope
Indonesia IV, 1995, hal 1002 = USP XXVII).

Yang terlibat dalam

kromatografi

Solut atau zat terlarut yang terdistribusi di antara kedua fase

Dua fase : fase diam dan fase gerak
Fase gerak membawa serta zat terlarut melalui suatu media
( dalam hal ini fase diam) hingga terpisah dari komponen lainnya,
yang terelusi lebih awal atau lebih akhir
Zat terlarut dibawa serta melewati fase padat oleh aliran pelarut
(fase gerak dlm bentuk cair atau gas ) disebut juga eluen atau cairan
pengembang.
Fase diam berbentuk padat bertindak sbg penjerap (adsorben) atau
bentuk cairan yang terikat pada permukaan padat (support padat)
sehingga terjadi partisi (distribusi) diantara kedua fase tersebut.

Kotak hitam kromatografi

Variabel terkontrol :
Kolom, laju alir, suhu, fase gerak,

Selektifitas ,

Kepekaan
Sampe
l

PEMISAHAN

PENCIRIAN

Kromatogra
m

(deteksi)

APLIKASI:

KROMATOGRAF

Variabel tdk terkontrol :

Kinerja kolom, stabilitas aliran,

Noise, Drift

Identifikas
i,
Kemurnian
,
Penetapan
kadar

Klasifikasi Kromatografi
1. Berdasarkan bentuk geometri :
Kromatografi Kolom (menggunakan kolom klasik atau
kolom kapiler/modern)
Kromatografi Planar (fase diam berupa bahan padat
yang tersebar rata di atas lempeng kaca, plastik atau
logam)
2.

Berdasarkan sifat fisika analit atau fase

gerak:

Kromatografi gas (sampel harus menguap agar terbawa

oleh fase gerak yang berupa gas),
Kromatografi cair ( sampel harus larut dalam pelarut
atau salah satu komponen fase gerak yang berupa cair)

KROMATOGRAFI
GAS
PADAT

Berdasarkan Fase
diamnya :

KOLO
M

Padat (dinamakan
Kromatografi Gas
Padat)
Cairan (Kromatografi
Gas Cair)

CAIRAN (yang melekat

pada pendukung
padat)
Fase gerak

ADSORPSI (KGP)
PARTISI (KGC)

Berdasarkan Mekanisme
Pemisahan :
Adsorpsi (Kromatografi
Adsorpsi)
Partisi (Kromatografi Partisi)

Fase diam
Pita terpisah

KROMATOGRAFI CAIR
PADAT
KOLO
M
CAIRAN

KLASIK (kolom besar)

KINERJA TINGGI

PLANAR
KERTAS
LAPIS TIPIS
PADAT

ADSORPSI
PARTISI
FASE TERIKAT

ADSORPSI

PENEKAN ION

PARTISI

PASANGAN

KIRALITAS
(Stereoisomer)

ION
PERTUKARAN ION
EKSKLUSI UKURAN
AFINITAS
KIRALITAS

KROMATOGRAFI CAIR
SUPERKRITIK (fase gerak berupa
gas pada suhu dan tekanan di
atas titik kritiknya: misalnya gas
CO2)

KROMATOGRAFI
KOLOM

Fase gerak

Fase diam

PARTIS
I

Pada Kromatografi gas

Fase gerak : hanya membawa
analit melalui fase diam. Laju aliran
fase gerak berpengaruh pada hasil
pemisahan
Fase diam : sangat berperan atau
turut serta dalam proses
pemisahan.
Suhu (injektor, kolom, detektor)
sangat berpengaruh pada
pemisahan.

Pada Kromatografi cair

Sampel, fase diam, fase gerak, ketiganya
berinteraksi dan berperan dalam pemisahan
sehingga lebih intensif (terutama polaritas, ukuran
molekul, afinitas, sifat permukaan fase diam dan
sifat fisiko kimia fase gerak).
Fase gerak berfungsi membawa zat terlarut
(dalam salah satu komponen fase gerak) melalui
fase diam. Laju alir fase gerak akan berpengaruh
pada waktu retensi.
Fase diam berupa bahan padat atau cairan yang
terikat atau tersaput pada bahan pendukung padat
Suhu juga berpengaruh pada kinetika pemisahan
dan waktu retensi.

Proses pemisahan pada

kromatografi cair (kolom)
Elusi
melalu
i kolom
dgn
arah
tertent
u

2
pelaru
t

Eluen

Kromatogra
m

Mekanisme Pemisahan
umum
Pemisahan kromatografi dicapai dengan mengendalikan
dan menciptakan interaksi antara : analit -fase gerak
-fase diam
Adanya interaksi antara analit-fase diam-fase gerak
menyebabkan migrasi analit yang berbeda.
Perbedaan migrasi menunjukkan waktu retensi
(kromatografi kolom) atau nilai Rf (kromatografi planar)
relatif
Pada kromatografi kolom: fase gerak mengalir karena
adanya perbedaan tekanan pada kedua ujung kolom
Pada kromatografi planar: fase gerak menaik atau
menurun karena gaya kapiler dan gaya berat/gravitasi
Komponen yg berinteraksi kuat dengan fase diam
akan ditahan lebih lama dan yang lemah atau tidak
berinteraksi akan terbawa fase gerak dengan laju
migrasi yang berbeda.

Pemicu (Driving Force)

PEMISAHAN KROMATOGRAFI
1. Kesetimbangan yang
menggambarkan distribusi Analit
dalam kedua fase (fase diam dan
fase gerak).
2. Kinetika gerakan/mobilitas
Analit karena adanya perbedaan
(gradien) konsentrasi pada saat
melewati (difusi) fase diam.

1. Kesetimbangan
Analit A terdistribusi dalam fase diam dan
fase gerak

Am
(fase gerak)

Fase diam

Fase gerak

KOEFISIEN DISTRIBUSI
(PARTISI)
KD= Cd/Cm

Ad

(fase diam)

a. Adsorpsi

Molekul analit
teradsorpsi pada
permukaan fase
diam (adsorben)
X=solut
S=pelarut

Xm + n Sads Xads + n Sm
Fase diam :
Silikat

Kads = [Xads] [Sm]n/[Xm]

[Sads]n

b. Partisi
(Fase terikat, Pasangan ion, Penekanan ionik)
Am Ad,
KD=[Ad]/[Am]= Cd/Cm
Partikel padat
(pendukung)

Lapisan tipis cair

(fase diam yg cair)

Fase
diam:
=OH
Si

Cl
+

R
Si

-O

Si
=OH

Cl

-O

R= C-8 dan C-18 (kurang

polar)
atau -CN, -NH2 (polar)
R = CH3

c. Pertukaran ion
Terjadi kompetisi antar ion yang terlibat. Ada
cation exchanger, atau anion exchanger
Fe

Fe
Cu

2+

, Fe

Fe
H

Cu

2+

,H

H
Fe

Fe

3+

Resin penukar ion

MR+Y- + X- MR+X- + MR+X- +

Yatau
MR-Y+ + X+ MR+X- + MR-X+ +
Y+

X-, X+ = ion sampel

Y-,Y+ = ion lawan

Kesetimbangan pada
kromatografi penukar ion

d. Eksklusi Ukuran (Size

exclusion)
Molekul
analit
Pori-pori

Matriks gel

Molekul
pelarut

KD = Cs/Cm
VR = Vo + KDVi
KD = [VR V0]/[Vi
V0]

Molekul kecil
masuk ke dlm
gel
Molekul besar
ditolak tdk dpt
masuk pori,
maka terelusi
lebih awal:
KD=0
besar

mol

KD=1
kecil

mol

Istilah/simbol dalam kromatografi

LAMA
SIMBOL

BARU
ARTI

SIMBOL

ARTI

Faktor selektifitas

Faktor pemisahan

Tinggi Setara Pelat

Teoritis

Tinggi Pelat
/Lempeng

Faktor kapasitas

Faktor Retensi

Jumlah Pelat Teoritis

Jumlah Pelat
/Efisiensi

HETP

neff

Jml efektif pelat teoritis

Neff

Jml pelat efektif

tm

Mobil Phase Holdup

time

tM

Mobil Phase
Holdup time

tr

Waktu retensi

tR

Waktu retensi

tr

Wakt retensi yg diatur

tR

Wakt retensi yg
diatur

Lebar bawah/dasar
puncak

Wb

Lebar puncak

 Istilah dan simbol pada kromatografi

disepakati berdasarkan rekomendasi
IUPAC yg dipublikasi pd thn 1993 dan
2001
Ettre, LC., The New IUPAC
Nomenclature for
Chromatography, LC-GC, 11(7),1993,
p.502
Majors and Carr,Glossary of Liquid
Phase Separation Terms, LC-GC,
19(2), 2001, p.124.
Lihat pula :
www.chromatographyonline.com
www.zurchrom.com/pdf/glossary/pdf