Anda di halaman 1dari 77

APLIKASI

KROMATOGRAFI
Slamet Ibrahim S.
Sekolah Farmasi ITB

Uji Kesesuaian Sistem


(UKS)

UKS ditujukan utk memastikan efektivitas


sistem operasional dari sistem kromatografi
sebelum digunakan untuk tujuan analisis
(terutama analisis Kuantitatif).
Parameter UKS :
1. Keberulangan penyuntikan/penotolan :
Simpangan Baku Relatif (SBR)
2. Faktor ikutan
3. Resolusi
4. Jumlah lempeng efektif (Nef)
5. Retensi relatif

Kotak hitam Kromatograf

Sistem kromatograf
Fase diam (Kolom dan lempeng )
Pompa (KCKT)
Fase gerak (KC dan KG) atau Cairan
pengembang (KLT)
Detektor
Sistem elektronik
Analit

1. Keberulangan penyuntikan
Dari penyuntikan ulang larutan baku
pembanding, yang dinyatakan sebagai
Simpangan Baku Relatif (SBR)
(Xi
SBR(%) = ---------------------X)2
X
n1
100

SBR = simpangan baku relatif (%)


X
= harga rata2 dari n kali penyuntikan
Xi
= pengukuran individual/waktu retensi atau luas
puncak atau
tinggi puncak kromatogram
n
= jumlah penyuntikan (n 6 kali penyuntikan
ulang)

Disamping waktu retensi, keberulangan


dapat dinyatakan dalam luas di bawah
kurva atau tinggi kromatogram.
Bila digunakan baku dalam, maka
Xi = RS (i) = rs /ri = As/Ai
Xi = ratio respon (luas/tinggi) puncak
baku acuan terhadap baku internal
Jika SBR 2% maka berarti sistem
memenuhi persyaratan.

2. Faktor ikutan/simetris
()
Untuk membatasi bentuk kromatogram
yg tdk simetris (untuk menguji
kesimetrisan puncak kromatogram)
= perbandingan jarak tepi muka
sampai belakang puncak yg diukur dari
titik yg ketinggiannya 5% dari puncak
maksimum (0,05 h)
Simetris ,bila =1,
tidak simetris, bila 1 ,
Berekor, bila > 1, melambung ke depan
<1

Puncak maksimum

h
f

W0.05

= W0.05 / 2
f

0.05 h (5% tinggi)

3. Resolusi (Rs)
Diuji untuk memastikan terpisahnya
komponen2 yg terelusi berdekatan dan
utk memastikan efisiensi sistem secara
umum atau bila digunakan baku
dalam/internal
:
t 2
R

Rs = 2 (tR2 tR1)/
W1+W2

tR1

R 1,5

W1

N=16 (tR/W)

W2
2

tR=wkt retensi kedua


komponen
W=lebar dsr puncak yg
diperoleh dg cara ekstrapolasi
tepi puncak yg relatif lurus
smp garis dasar

Contoh perhitungan resolusi


Jika X = tR = 4
dan W1 = W2 = 4
maka Rs = (2. 4)/(4 +
4)
= 1,0
Belum terpisah dengan baik
Jika X = tR = 6
dan W1 = W2 = 4
maka Rs = (2. 6)/(4 +
4)
= 1,5
Sudah terpisah dengan
baik.

4. Jumlah lempeng
teoritis (N)
Diuji untuk memastikan effisiensi kolom
dalam pemisahan.
Makin besar nilai N makin effisien
pemisahan yang terjadi.

N=16
(tR2/W2)

tR2
tR1

W1

W2

tR=waktu retensi
komponen
W=lebar dasar puncak

5. Retensi Relatif ()
Untuk memastikan identitas senyawa
dibandingkan baku pembanding
= (tR tm) / (ti tm)
Kadang diuji untuk memastikan
keterpisahan komponen yg diuji dari
komponen lain yang ditetapkan
= t(R)A/t(R)B
dimana t(R)A waktu retensi komponen
utama dan t(R)B waktu retensi
komponen tertentu

Contoh kriteria penentuan kondisi


percobaan dan kesesuaian sistem KCKT
Parameter percobaan

Kriteria

Tekanan

100 200 bar

Faktor kapasitas

2 < k < 5

Faktor selektivitas

>1

Efisiensi kolom

N 10.000/m

Resolusi

R 1,5

Faktor ikutan/simetris

Tf = 1

Laju aliran

1 2 mL/menit

Keberulangan penyuntikan

SBR< 2%

Waktu pemisahan

1- - 20 menit

Kromatogram

Lancip, tajam, tidak melebar&tdk


berekor

Penggunaan pelarut

minimal

Detektor pada Kromatografi Kolom


(Kromatografi Gas atau KCKT)
Detektor : suatu peralatan (gawai) yg
mendeteksi dan mengukur banyaknya
komponen yang terpisahkan dalam fase gerak
yg keluar dari kolom
Detektor menyuplai sinyal sebagai tanggapan
dari solut yang terpisah
Jenis detektor dalam KG dan KCKT dapat
dilihat di Kuliah Analisis Farmasi Fisiko
Kimia ( Analisis Instrument).
Karakter Detektor bersifat :
Detektor Integral
Detektor Diferensial

Detektor Integral
Tanggapan berbanding lurus
dengan massa total komponen
dlm daerah yg dielusi
Fase gerak murni rekorder
menunjukkan garis lurus
Komponen menunjukkan
tingkatan

respo
n

Detektor Jenis Integral


Tinggi kadar komponen yang
terelusi dalam rentang waktu t4t3
Tinggi kadar komponen yang
terelusi dalam rentang waktu t2t1

t1

t2

t3

t4 wakt
u

Detektor Diferensial
Kromatogram berupa puncak2
Masing2 puncak menggambarkan
komponen yang terpisahkan oleh
sistem kromatografi yang digunakan.
AUC (Area Under Curve = luas
daerah) berbanding lurus dgn massa
total komponen yg terelusi dalam
rentang waktu t2 t1
Lebih umum dan banyak digunakan
karena kesesuaiannya yang tinggi

Luas daerah (AUC)


berbanding lurus dgn
massa total komponen yg
terelusi dlm rentang
waktu t4-t3

tR2
tR1

t3

t4

Detektor diferensial lebih umum


digunakan karena kesesuaian dan
ketelitian yg tinggi

Penampak Bercak pada


Kromatograf Planar
Solut yang terpisahkan berupa
pita/zona atau bercak
Senyawa berwarna
Senyawa tidak berwarna perlu
dilakukan pewarnaan/penampakan
Cara penampakan : merusak dan tidak
merusak
Tujuan kualitatif dan kuantitatif
Cara tidak merusak : penyinaran dgn
lampu uv

Identifkasi pada Kromatograf Kolom dan


Kromatograf Planar
sampe
l

pembandin
g

Sampel+pembandi
ng

KROMATOGRAFI

Kromatogram KCKT dan KG


berupa uncak-puncak

Kromatogram KLT berupa


Bercak/noda

Analisis Kualitatif/Identifikasi
Pada Kromatografi kolom :
kromatogram analit dibandingkan
dengan kromatogram senyawa
pembanding dengan menggunakan
Waktu retensi (tR), atau volum retensi
(vR) sebagai parameter identitas.
Pada Kromatografi lapis tipis: bercak
analit dibandingkan dengan bercak
senyawa pembanding dengan
menggunakan nilai Rf atau Rr sebagai
parameter identitas.

Identifkasi dengan KLT


Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah
teknik kromatografi cair dimana fase
diam berupa bahan padat penjerap
yang menyebar merata seperti lapisan
tipis atau film di atas lempeng kaca,
plastik atau logam.
Pemisahan berlangsung karena adanya
perbedaan adsorpsi, partisi, kombinasi
keduanya dan pertukaran ionik.
Pertama kali digunakan pada 1938 oleh
Ismailov dan Scraiber dari Ukranian
Institut of Experimental Pharmacy, dan
dikembangkan lebih lanjut oleh Egon
Stahl pada 1950..

Kriteria untuk identifikasi


Identifikasi pemastian menggunakan: harga
Rf analit dibandingkan terhadap harga Rf
baku pembanding.
Teknik spiking atau kokromatograf : menambahkan baku
pembanding ke dalam sampel lalu
dikromatografi dengan kondisi yang sama
Teknik spiking tidak dapat digunakan untuk
identifikasi sampel yg sama sekali tidak
diketahui.
Identifkasi tambahan : Spektrometri
(infra merah, massa, atau resonansi
magnet inti)

Cara identifkasi
Perkiraan identifikasi dapat dilakukan dengan
pengamatan bercak dan harga Rf zat uji yang identik
berukuran yang hampir sama dengan bercak bahan
pembanding serta bercak campuran zat uji dan bahan
pembanding.
Harga Rf sendiri tidak dapat langsung digunakan
sebagai dasar identifikasi karena nilainya sangat
tergantung pada kondisi percobaan yang dilakukan.
Faktor yang dapat berpengaruh pada nilai Rf
adalah: kualitas fase diam, komposisi larutan
pengembang, kejenuhan bejana pengembang, suhu,
jarak pengembangan dan jumlah sampel yang
ditotolkan.
Untuk menghindari hal ini, maka identifikasi dilakukan
dengan cara ko-kromatograf, yaitu dengan
menotolkan tiga bercak : zat uji, campuran (zat uji dan
bahan pembanding), serta bahan pembanding pada
lempeng yang sama.

Cara mengetahui posisi bercak:

Untuk menghitung harga Rf suatu bercak


maka perlu diketahui posisi bercak yang
telah terpisah dalam kromatogram dengan
cara:
1.Pengamatan langsung, untuk bercak
yang berwarna, atau yang tampak
dibawah sinar biasa atau sinar UV.
2.Direaksikan dengan pereaksi kimia
tertentu dengan cara disemprotkan atau
dibacam. Pereaksi yang digunakan disebut
pereaksi penampak bercak.
3.Dengan cara bioautograf menggunakan
bakteri.

Nilai/Harga Rf:
Senyawa A =
(a/S)
Senyawa B =
(b/S)

Identifkasi dengan KCKT


dan KG
Pada dasarnya peralatan KCKT dan KG terdiri dari
sistem pemasok fase gerak (gas atau cairan) ,
gerbang suntik, kolom, detektor, penguat sinyal
dan perekam data (biasanya digabung dalam
sistem komputer).
Sistem pemasok mengalirkan fase gerak ke dalam
kolom. Sampel disuntikkan melalui gerbang suntik
dengan sistem loop ke dalam kolom. Aliran fase
gerak yang membawa analit akan keluar dari
ujung kolom yang lain dan dideteksi oleh detektor.
Kadar zat uji yang kecil < 20 g maka diperlukan
suatu detektor yang sensitif dan selektif.
Dengan teknologi ini menghasilkan pemisahan
dan sekaligus pencirian yang cepat.

Sistem Instrumentasi KCKT

Instrumentasi Kromatograf
Gas
Filters/Traps

Data system
H

RESET

Regulators

Syringe/Sampler
Inlets
Detectors

Gas Carrier

Hydrogen

Air

Column

Cara identifkasi
Dengan menggunakan detektor diferensial
kromatogram akan memunculkan puncakpuncak yang menggambarkan komponen
yang terdapat dalam suatu sampel.
Untuk identifikasi kromatogram senyawa uji
dibandingkan dengan kromatogram baku
pembanding yang dikromatografi dalam
kondisi yang tetap sama (tekanan, laju alir,
suhu, fase gerak dan kolom).
Sebagai parameter identitas digunakan
waktu retensi (tR ) atau retensi relatif
senyawa uji dibandingkan terhadap baku
pembanding.

Jika terdapat senyawa lain yang berbeda tapi


mempunyai waktu retensi yang sama, maka
dianjurkan menggunakan teknik Spiking
atau ko-kromatograf.
Di mana tiga jenis larutan disiapkan terdiri
dari larutan uji, bahan pembanding dan
larutan campuran keduanya. Ketiganya
dikromatografi dengan kondisi yang sama.
Waktu retensi puncak utama pada ketiga
kromatogram akan identik dengan
kromatogram yang dispike akan
memunculkan puncak yang lebih tinggi
karena ada penambahan dari bahan
pembanding.
Kalau ternyata puncaknya tidak bertambah,
maka dalam sampel diuji dapat dipastikan
tidak ada senyawa yang dimaksud.

2=A
suntik

3=B
4=C
6=D
8=E
1=?
5=?

suntik

7=?

Pada metode spiking baku pembanding yang


ditambahkan adalah sama dengan senyawa 2.
Pada kromatogram (b) terlihat puncak senyawa 2
lebih tinggi dari kromatogram (a).

Spiking suatu senyawa muncul sebagai puncak lain


pada waktu retensi yang berbeda , berarti senyawa
yang dimaksud tidak ada dalam sampel

Uji Kemurnian Kromatografi


Kemurnian kromatografi adalah uji kemurnian
yang dilakukan dengan kromatografi (KLT, KCKT
dan KG).
Selalu dibandingkan terhadap senyawa
pembanding utama dan atau senyawa
cemarannya.
Kriteria Umum:
Tidak ada bercak atau puncak lain selain
bercak atau puncak utama maka senyawa
disebut murni (pada batas tertentu).
Konsentrasi cemaran yang masih diperbolehkan
dalam sampel dapat dihitung dengan cara
pengenceran atau analisis kuantitatif biasa.

Berkat keunggulan yang dimilikinya, teknik


kromatografi sering digunakan untuk
mendeteksi adanya dan menghitung
kandungan cemaran organik dalam bahan
aktif farmasi, makanan atau kosmetik.
Kromatografi lapis tipis, kromatografi gas,
dan kromatografi cair kinerja tinggi
ketiganya direkomendasikan oleh
beberapa Farmakope dan Kompendia
(Kodeks).
KLT lebih banyak dipakai karena lebih
cepat, sederhana dan tidak memerlukan
keahlian yang khusus.

Uji cemaran umum secara


KLT
Uji cemaran umum yang tertera pada
monografi digunakan untuk menilai profil
cemaran suatu bahan. Uji cemaran tersebut
menggunakan KLT<481>, hal 947.
Fase diam digunakan silika gel P setebal
0,25 mm.
Fase gerak sesuai tertera pada monografi
Penampak bercak : bermacam-macam
sesuai monografi ( ada 22 jenis penampak
bercak KLT dalam FI IV).
Pengamatan : Tidak boleh ada bercak lain
selain dari bercak utama.

Prosedur umum pengujian


kemurnian dengan KLT adalah:
1. Cemaran sudah diketahui.
Cemaran yang dimaksud merupakan
hasil urai atau senyawa utuhnya.
Beberapa Farmakope telah
mencantumkan cemaran-cemaran
yang dimaksud (lihat BP dan USP).
2. Cemaran belum diketahui, masih
prakiraan saja atau belum sempurna
dinyatakan. Biasanya zat yang
berasal dari alam (tumbuhan dan
hasil bioteknologi/fermentasi)

A. Cemaran sudah diketahui.

Uji batas dengan KLT berdasarkan pada uji


pembandingan kromatogram larutan
lebih pekat bahan yang diuji dengan
larutan cemaran yang telah diketahui.
Intensitas dari bercak dari cemaran pada
kromatogram bahan yang diuji
dibandingkan dengan intensitas bercak
cemaran pada lempeng yang sama.
Bercak cemaran pada larutan bahan yang
diuji tidak boleh seintensif bercak
larutan baku pembanding cemaran pada
kromatogram yang sama.

Uji batas 4-epianhidro tetrasiklin


Fase diam :
Silika gel yang telah dicuci dengan HCL disuspensikan
dalam polietilen glikol 400 dalam gliserol dan Na EDTA 0,1 N
pH 7 lalu dibuat lapis tipis diatas lempeng kaca dan dibacam
dalam larutan amonium klorida.
Fase gerak:
Campuran Na EDTA pH 7, etil asetat, kloroform dan aseton
(1:1:3).
Penampak bercak:
Lampu UV 366 nm.
Larutan Uji :
Larutan 0,1% tetrasiklin dalam metanol.
Larutan baku cemaran:
Larutan 4-epianhidrotetrasiklin 0,005% dalam metanol.
Hasil pengamatan:
Kecuali bercak utama terdapat bercak lain yang tidak
lebih intensif dibandingkan dengan bercak baku cemaran.

Uji adanya Cemaran


hidrokortison dalam
hidrokortison asetat.
Bercak yang ditotolkan adalah 5 L
larutan 1% hidrokortison asetat (larutan
uji) dan 5L larutan 0,01% hidrokortison
(larutan baku cemaran), lempeng
dikembangkan dalam bejana yang berisi
campuran metilenklorida-etermetanol-air (77:15:8:1,2). Bercak
diamati di bawah lampu UV.
Hasil kalau intensitas bercak cemaran
pada larutan uji lebih kuat daripada
bercak larutan baku cemaran , maka
sampel tidak memenuhi syarat uji batas.
Batas yang dipersyaratkan adalah
[0,01/1] x 100 = 1% hidrokortison yang

Uji batas hidrokortison dalam


hidrokortison asetat Dengan
KLT

B. Cemaran tidak diketahui


Untuk mengujinya dilakukan penotolan
bercak dari larutan pekat dan larutan yang
encer (hasil pengenceran tertentu).

Misalnya : Uji cemaran pada kodein.


Dibuat bercak 10L: Larutan 4,0% kodein (larutan
1), 0,06% kodein (larutan 2) dan 0,04% kodein
(larutan 3). Lempeng dikembangkan dalam bejana
berisi campuran etanol-siklohexan-amonia (72:30:6).
Bercak disemprot dengan larutan Dragendorf.
Hasil amatan: Tidak boleh ada bercak lain disamping
bercak utama yang lebih intensif dari bercak larutan
2. Tidak boleh ada bercak selain bercak kedua yang
mempunyai Rf lebih besar dari bercak larutan 3.
Batas dua cemaran itu adalah:
a. cemaran I = 0,06/4 x 100 = 1,5%
b. cemaran II = 0,04/4 x 100 = 1,0%

Uji batas cemaran dalam


kodein

UJI CEMARAN SENYAWA MUDAH MENGUAP

Diuji dengan kromatografi gas. FI V


memuat prosedur uji cemaran senyawa
organik mudah menguap <471>,
Metode khusus yang digunakan dan
jenis metode yang diperlukan diuraikan
di dalam masing-masing monografi.
Yang termasuk cemaran mudah
menguap adalah antara lain pelarut
organik atau gas yang digunakan
dalam pembuatan bahan baku atau
proses pembuatan sediaan dan
sterilisasi atau cemaran hasil urai bahan
baku.

Pengujian batas residu pelarut


dengan KG
Merekomendasikan jumlah residu pelarut
yang dapat diterima dalam obat demi
keselamatan pasien/pengguna.
Residu pelarut adalah Bahan pelarut organik
yang mudah menguap yang digunakan
dalam pembuatan obat atau eksipien atau
dalam pembuatan obat jadi.
Pelarut tersebut tidak dapat sepenuhnya
dapat dihilangkan oleh prosedur/teknis yang
digunakan dalam proses manufaktur.
Sedangkan penggunaan pelarut tersebut
sangat berperan dalam karakteristik obat,
seperti bentuk kristal, polimorfisa, kemurnian
dan klarutan bahan baku obat.

Klasifkasi Pelarut
Kelas I : Pelarut-pelarut yang harus dihindari
dan tidak boleh ada pada sintesis obat atau
eksipien, dan pada proses formulasi obat jadi
karena bersifat karsinogenik pada manusia
dan sangat membahayakan lingkungan.
Kelas II: Pelarut-pelarut yang bersifat
karsinogenik pada hewan tetapi bersifat nongenotoksik atau menyebabkan kemungkinan
toksis seperti neurotoksik atau teratogenik.
Kelas III: Pelarut-pelarut kurang beracun atau
yang toksisitasnya rendah pada manusia

Bermacam-macam prosedur/metode
yang dilakukan dalam FI V adalah
Metode I hingga metode VI, dan metode
khusus untuk metilen klorida.
Teknik analisis KG : Headspace
analysis,
Dalam prosedur ini sampel ditempatkan
dalam vial yang bertutup karet kuat
bersama-sama pelarut yang tidak
menguap misalnya air. Vial dipanaskan
dan dikocok hingga setimbang dan
sebuah alat suntik diinjeksikan ke dalam
vial tsb lalu disedot sejumlah 1 ml gas
yang ada di atas campuran tsb.
Kemudian diinjeksikan ke kromatograf
gas.

Pengambilan sampel pada


headspace analysis

Karakter yang baik dari


detektor
Memberikan sensitivitas dan selektifitas yang
mencukupi bagi analit dalam sampel yang
digunakan.
Menunjukkan rentang dinamik linear yang
lebar.
Dapat bekerja pada rentang suhu yang lebar.
Memberikan respon dalam waktu yang singkat.
Mudah dioperasikan.
Hasil pengukuran stabil dan responnya dapat
diprediksi.
Tidak merusak analit (nondestructive)

Karakteristik Khusus Detektor


KCKT
Jenis
Detektor

Sifat

Noise
level

CN
Rentang
(g/cm3) Linear

Volume
Sel
( L)

1. UV-VIS
2. Fluoresensi
3. Konduktivit
as
4. Amperomet
ri
5. Indeks Bias

Selekti
f
Selekti
f
Selekti
f
Selekti
f
Umum

10-4 au
10-7 au
10-2 S/cm
0,1 nA
10-7 riu

10-8
10-12
10-7
10-10
10-6

18
8 25
15
0,5 5
5 - 15

10 4 105
103 - 104
103 104
104 105
103 - 104

Jenis detektor yang dipakai KG


1. Thermal Conductivity
Detector (TCD)
2. Flame Ionization
Detector (FID)
3. Electron Capture
Detector (ECD)
4. Nitrogen Phosphorus
Detector (NPD)
5. Flame Photometer
Detector (FPD)
6. Electrolytic
Conductivity Detector
(ELCD)

7. Photoionization Detector
(PID)
8. Mass Selective Detector
(MSD)
9. Infra Red Detector (IRD)
10. Atomic Emission Detector
(AED)
11.Helium Ionization Detector
(HID)
12.Redox Chemiluminescence
Detector (RCD)
13.Thermionic Ionization
Detector (TID)

Watak penting detektor KG


JENIS DETEKTOR

GOLONGAN SENYAWA YANG


DIANALISIS

TCD
FID
NP- FID
ECD

Sebagian senyawa organik termasuk


obat
Sebagian senyawa organik
Senyawa Fosfor, Nitrogen, Sulfur dan
Halogen
Senyawa Halogen, Teroksigenasi, Sangat
terkonyugasi
Senyawa Fosfor dan Sulfur
Semua senyawa yang berpotensial <
10,2 eV

FPD
PID

Analisis Kuantitatif
Diperlukan detektor yang harus tanggap
terhadap konsentrasi analit.
Secara umum berlaku persamaan R = k
C
Dimana R = Respon detektor
k = tetapan proporsionalitas
C = konsentrasi analit
Respon detektor dapat berupa luas
dibawah kurva (AUC), tinggi puncak
(H) atau ratio respon Ratio =
AUC1/AUC2 atau (H1/H2)

Jika luas daerah puncak kromatogram (Area Under


Curve = AUC) = A, maka
A = k. (M/F), dimana F=laju alir, M=massa
Persamaan A = k.M/F yg menunjukan luas puncak
berbanding lurus dengan massa keseluruhan
komponen.
Faktor koreksi F harus diketahui
Detektor juga harus tanggap terhadap laju alir
massa (dm/dt), maka persamaan akan berubah:
A = k.M,
disini aliran massa tidak mempengaruhi lagi
jumlah
komponen analit.

Sumber galat yg mungkin pada


analisis kromatograf kuantitatif
Cara sampling :
Representatif (homogen)
Semua sampel masuk kedalam sistem
kromatografi

Adsorpsi kuat atau penguraian sampel


Kinerja detektor
Kinerja perekam
Cara integrasi manual
Cara perhitungan

Kurva Kalibrasi (baku) pada


Penetapan Kuantitatif
Metode baku luar (external standard, dilusi)
Metode baku tinambah (standard addition)
Metode baku dalam (internal standard)
Persamaan umum hubungan linier antara Respon
dengan Konsentrasi adalah :

R = bC + a
R=respon instrumen utk parameter yg diukur
C=konsentrasi analit
b=tetapan proporsionalitas
a=tetapan empirik (sebagai nilai blangko yaitu larutan
yg
didalamnya tidak ada analit)

Profl Kurva kalibrasi


(baku)
R
R = bC + a

Rn

b = arah garis
= MN/LM
= (RnRn-1)/(Cn Cn-1)

b
Rn-1

M
L

a=perpotongan dgn sumbu


Y
= merupakan galat tetap

a
C
Cn-1

Cn

Metode baku luar


(External Standars method)
Teknik pembuatan kurva kalibrasi : membuat serangkaian
konsentrasi senyawa baku dgn konsentrasi yg diketahui
Senarai larutan baku pembanding dengan pengenceran
bertingkat (minimal 6 konsentrasi lalu dilakukan pengukuran
respon minimal 3 kali (triplo) dan diambil nilai rataannya.
Kurva kalibrasi dibuat dgn cara :
Grafikal (pakai kertas grafik mm)
Statistik

Respon digambar sebagai sumbu tegak (Y) dan kadar baku


pembanding pada sumbu datar (X)
Asumsi : Hanya nilai pada sumbu Y yang mengandung galat dan
nilai pada sumbu X dinyatakan bebas galat.
Taksiran kelurusan/linearitas menggunakan koefisien korelasi
momen kali (r).

Kurva kalibrasi baku luar


Pers garis R = bC + a, dimana
x
x
Ru

x
x
x
x

R=Respon instrumen terhadap


larutan
baku pembanding.
C=konsentrasi larutan baku
b=arah/lereng garis
a=titik potong dgn sumbu Y

C1
C2
Cu
C3
Koefsien
korelasi (r) = taksiran kelurusan/linier
Nilai r berada dlm rentang -1 r +1
Untuk analisis kurva yg baik r nya dlm rentang r
> 0,99

Modifkasi Perhitungan
kadar
1. Menggunakan larutan baku tunggal
. Asumsi :

Sistem tidak mempunyai galat tentu (galat sistem)


Pereaksi dan pelarut (matriks) yang digunakan
memberi nilai blangko = 0 (zero blank)

. Kurva : R = bC + a,
bila C = 0 (blangko) maka R = a
bila a = 0, maka R = bC
. Maka konsentrasi larutan uji dapat dihitung
dengan :
Cu = (Ru/Rb) Cb = (Au/Ab) Cb =
(Hu/Hb)Cb

2. Menggunakan baku tunggal dan


blangko
. Asumsi :
Sistem tidak mempunyai galat tentu
Sistem memberikan nilai blangko
yang tetap

. Pengukuran respon blangko (Ybl)


digunakan untuk koreksi pada
respon larutan baku (Yb) dan
larutan uji (Yu)
. Cu = (Yu-Ybl/Yb-Ybl) . Cb

Metode baku Tinambah


(Standard Addition Method)
Kurva baku tinambah digunakan bila:
Kadar dalam sampel sangat kecil, atau
keterukuran analit dalam sampel
sangat rendah, atau matriks
berpengaruh pada pengukuran.
Larutan baku pembanding dengan berbagai
konsentrasi ditambahkan pada larutan uji
lalu diukur masing-masing responnya
minimal triplo dan dibuat kurvanya.
Respon (R) digambar sebagai sumbu Y dan
konsentrasi baku tinambah (Cn) sebagai
sumbu X.

Ro = b . Cu

dan Ri = b (Cu + Ci)

Ro/Ri = (b.Cu)/ b (Cu + Ci) = Cu/(Cu + Ci)


Maka

Ri = (Ro/Cu).Ci + Ro

Y = b.C + a, dengan b = (Ro/Cu) dan a


= Ro
dan Cu = Ro/b = (a/b)
b=
Ro/Cu

Ri
Yo

Ci

Y = bC + a

Perhitungan kadar dengan


baku tinambah tunggal
Larutan uji (dengan kadar C u) diukur
responnya = Ru
Larutan uji yang ditambahi larutan baku
tinambah (dengan kadar Cu + Ci)
diukur responnya Ri
Maka Ru/Ri = Cu/(Cu + Ci)
RiCu = RuCu + RuCi
Cu (Ri Ru) = Ru.Ci
Cu = (Ru.Ci)/(Ri Ro)

Metode Baku Dalam


(Internal Standard method)
Asumsi :
Kadaranalit dalam sampel untuk kalibrasi dan analisis lebih
akurat
Galat hanya terdapat pada pada pengukuran saja

Prosedur analisis :
Pembuatan kurva
Menaksir kadar sample uji
Menggunakan baku dalam tunggal

Dalam metode ini respon detektor yang diberikan


analit dibandingkan dengan respon yang diberikan
senyawa lain kadar tertentu (baku dalam), yang
ditambahkan ke dalam sampel kalibrasi maupunl
arutan sampel uji
Baku dalam bukan komponen dari sampel dan terukur
secara terpisah dari analit (Resolusinya tinggi)

Pembuatan kurva baku dalam


Kurva kalibrasi/baku dibuat dengan menyiapkan
senarai minimal 6 larutan baku pembanding
dengan konsentrasi yang berbeda sebagai hasil
pengenceran bertingkat.
Kepada masing-masing larutan baku tersebut
ditambahkan sejumlah tertentu larutan baku
dalam yang telah diketahui kadarnya.
Masing-masing larutan tsb diukur respon
kromatografinya.
Diperoleh puncak larutan baku dalam yang
terpisah (Rs > 1,5) dengan puncak larutan analit
pada kromatogram. Posisinya puncak tergantung
pada perbedaan sifat alami baku dalam dan analit.

Kromatogram pada kalibrasi baku


dalam
Larutan
Analit

Baku
dalam

Perhitungan dengan metode baku dalam

Jika respon larutan analit Ri = miCi,


dan respon baku dalam Rb = mbCb
Maka Ri /Rb = mi.Ci/mb.Cb , dan
k = mi/mb
Bila b = k/Cb, maka (Ri/Rb )= b. Ci
Bila ratio (Ri/Rb) diplot terhadap Ci
maka akan diperoleh garis lurus
dengan arah/kemiringan garis = b .

Kurva kalibrasi dengan baku dalam


Pers garis R= bC + a, dimana

Ratio

(Ri/Rb
)

x
x

C=konsentrasi lar.baku
pembanding analit.

x
x

b=arah/lereng garis

x
C1
C3

Y= Ratio antara respon


larutan uji terhadap respon
larutan baku dalam ( Ri/Rb)

C2

Cu

C4

a=titik potong dgn sumbu


tegak Y
C5
Kadar baku Pembanding

Koefisien korelasi (r) = taksiran kelurusan/linier


Untuk analisis kurva yg baik r nya dlm rentang r > 0,99

Perhitungan kadar dengan


baku dalam tunggal
Larutan uji (dengan kadar Cu) ditambahkan
sejumlah tertentu baku dalam dan diukur
responnya = Ru dan Rd dengan ratio
ru = Ru/Rd
Larutan baku yang ditambahi larutan baku
tinambah (dengan kadar Cb + Cd) diukur
responnya Rb dan Rd dan ratio
rb = Rb/Rd
Maka
ru/rb = Cu/Cb
Cu = (ru/rb).Cb

Syarat Baku dalam


Tidak terdapat dalam sampel.
Harus terpisah dari komponen yg
ada dalam sampel (Rs > 1,5).
Tidak boleh bereaksi dengan
komponen yang ada dalam
sampel.
Harus bercampur sempurna
(melarut) dalam pelarut yang
digunakan.

TAHAPAN ANALISIS
SAMPEL

- Penyaringan
-

Penyiapa
n larutan
baku

Penyiapan
sampel

Pelarutan

- Pemisahan
Analitik
- Derivatisasi
- Clean up

Pengukuran

Perhitungan dan
statistika

Hasil analisis

- dan lain-lain

Tahapan Analisis dengan Kromatograf


Penyiapan larutan uji (sampel): meliputi proses
pelarutan, pemisahan/ekstraksi, penggunaan
internal standard (pada analisis kuantitatif), cleanup, penguapan pelarut dan rekonstitusi.
Penyiapan larutan baku pembanding (dengan
proses yang sama dengan larutan uji).
Penyuntikan atau penotolan masing-masing
larutan uji dan larutan baku.
Pembandingan kromatogram uji dengan baku
pembanding (pencatatan respon berupa luas
kurva (AUC) serta waktu retensi (tR) puncak
utama atau nilai Rf bercak masing-masing pada
kromatogram).
Perhitungan.

Terima kasih