IMUNOBLOTTING (Western Blot)

PENGERTIAN BLOT
Blot adalah teknik untuk mentransfer DNA,
RNA dan protein ke pembawa sehingga mereka
dapat dipisahkan, dan sering
menggunakan elektroforesis gel. Southern blot
digunakan untuk mentransfer DNA, Northern
blot digunakan untuk mentransfer RNA dan
Western blot untuk mentransfer PROTEIN.

WESTERN BLOT
Western Blot adalah sebuah
analisis teknik yang
digunakan untuk mendeteksi
protein spesifik dalam
bentuk sampel jaringan
homogen atau ekstrak

WESTERN BLOT
Manfaat :
1. Untuk mengidentifikasi dan memposisikan
protein berdasarkan kemampuannya untuk
berikatan dengan antibody yang spesifik sehingga
sehingga dapat dilakukan pengembangan lebih
lanjut seperti pembuatan detektor, pembuatan
vaksin, dan hal lain yang dapat bermanfaat bagi
kehidupan manusia.
2. Dapat memberikan informasi tentang ukuran
dari protein

PRINSIP PEMERIKSAAN
Prinsip yang digunakan dalam western blot adalah
prinsip ikatan komplek antigen-antibodi. Protein
pada nitrocellulose (NC) dianggap sebagai antigen.
Antibodi primer adalah antibodi yang dapat
berikatan secara spesifik pada antigen pada NC.
Agar dapat melihat ikatan komplek dari antigenantibodi maka kita memberikan warna pada
antigen-antibodi tersebut.
SDS PAGE merupakan prasyarat untuk Western
blotting.

LANGKAH PEMERIKSAAN

Tissue preparation
Gel electrophoresis
Transfer
Blocking
Detection
Analysis

TISSUE PREPARATION
Sampel dapat diambil dari jaringan keseluruhan atau
dari kultur sel
Perlu dicatat bahwa sampel bakteri, virus atau
lingkungan bisa menjadi sumber protein dan karena itu
Western blotting tidak terbatas pada studi seluler saja.
Deterjen berbagai macam, garam, dan buffer dapat
digunakan untuk mendorong lisis sel dan melarutkan
protein.
Persiapan jaringan sering dilakukan pada suhu dingin
untuk menghindari denaturasi protein.

GEL ELECTROPHORESIS
Teknik pemisahan komponen atau
molekul bermuatan berdasarkan
perbedaantingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran.
Prinsip yang terlibat adalah perbedaan dalam
Mobilitas elektroforesis dari protein-protein
yang berbeda.

TRANSFER
Untuk membuat protein dapat dideteksi oleh
antibodi, gel dipindahkan ke membran yang
terbuat dari nitroselulosa.
Membran ditempatkan di atas gel, dan
setumpuk kertas filter ditempatkan di atas dari
itu. Seluruh tumpukan ditempatkan dalam
larutan penyangga yang bergerak
keatas kertas dengan aksi kapiler, membawa
protein dengan itu.

BLOCKING
Membran memiliki kemampuan untuk mengikat protein
dalam hal ini baik target dan antibodi adalah protein dan
disana dapat terjadi ikatan yang tidak diinginkan.
Pemblokiran ikatan yang non-spesifik dapat dicapai
dengan menempatkan membran dalam larutan encer
protein - biasanya Bovine serum albumin (BSA) dan juga
seperti Tween 20.
Protein dalam larutan encer mengikat membran di semua
tempat di mana protein target tidak terikat. Jadi, ketika
antibodi ditambahkan, tidak ada ruang di membran itu
untuk melekat selain pada tempat target protein spesifik.

DETECTION
Selama proses deteksi, membran ini "diselidiki"
untuk protein dengan dimodifikasi antibodi
yang terkait dengan enzim, yang ketika terkena
substrat yang tepat akan terjadi reaksi
kolorimetri dan menghasilkan warna.

ANALYSIS
Perkiraan ukuran diambil dengan
membandingkan band bernoda dengan yang
penanda yang dimuat selama elektroforesis.
Intepretasi hasil dari western blot mirip dengan
SDS-PAGE elektroforesis. Kita menggunakan
persamaan regresi linier dari marker yang
digunakan sebagai standart. Pita sampel yang
berwarna pada NC merupakan protein dengan
berat molekul tertentu yang kita hitung dengan
menggunakan persamaan regresi linier.

berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa).

Satu dalton sama dengan satu hidrogen molekul.