Anda di halaman 1dari 43

Kromatografi Kolom

Pri Iswati Utami

Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah tehnik yang sangat

penting untuk pemurnia produk sintesis atau


natural product.
Komponen dipisahkan dengan kromatografi kolom

melalui mekanisme yang sama seperti pada KLT;


Melalui perbedaan gaya intermolekuler komponen

campuran dengan fase gerak, dan antara


komponen dengan fase diam

Kromatografi Kolom

Komponen polar (b) teradsorpsi lebih kuat pada silika

yang polar dan terelusi belakangan setelah komponen


yang kurang polar (a) yang bergerak lebih cepat dengan
solven yang non polar (relatif terhadap silika)

Adsorben
Bermacam-macam adsorben dapat

digunakan sebagai fase diam;


Silica gel ,CaCO3, Cellulose,Starch dll.
Adalah adsorben yang umumdigunakan
pada kimia organik.

Fase gerak
Fase gerak / Solvent juga berperan

penting dalam kromatografi kolom.


Banyak tipe pelarut tersedia seperti
cyclo hexane, benzene, chloroform, dll.

Kolom
Dimensi kolom penting untuk

menghasilkan pemisahan
kolom yang efektif.
Rentangnya antara 1:10
sampai 1:100

Tipe Kolom:
1- Gravity Columns (kolom gravitasi):

Fase gerak bergerak melalui fase diam karena gaya


gravitasi.
2- Flash Columns (Air or nitrogen pressure):
Fase gerak didorong oleh aliran udara atau nitrogen
menggunakan alat khusus (Adaptors).

3-Low and Medium Pressure Columns


(pumped):
Pergerakan fase gerak dipercepat dengan
menggunakan pompa yang akan menghasilkan
tekanan rendah atau medium. Kenaikan
kecepatan alir akan memperpendek waktu
pemisahan.

4-Vacuum Columns [Vacuum liquid


chromatography (VLC)]:
Adsorben diaplikasikan dalam keadaan kering
ke dalam sintered glass funnel. Sampel
diaplikasikan dengan metode kering atau
sebagai larutan. Kemudian, fase gerak
ditambahkan porsi demi porsi dan vakum
diaplikasikan
setelah
tiap
porsi
untuk
mengumpulkan fraksi.

5- High pressure Columns (HPLC):


Pada kolom ini digunakan silica gel yang sangat
halus sehingga akan meningkatkan daya pisah.
Namun, kecepatan alir fase gerak sangat
diturunkan.
Pompa
bertekanan
tinggi
digunakan untuk mendorong solven melewati
kolom yang terbuat dari stainless steel.

Persiapan Kolom
Adsorben diaplikasikan ke dalam kolom dengan
dua cara:
Slurry packing (Wet method):
Adsorben disuspensikan dalam fase gerak
dan diaduk dengan sangat baik untuk
menghilangkan semua gelembung udara.
Bubur yang dihasilkan kemudian dituangkan
ke dalam kolom. Pada ujung kolom, sedikit
glass wool atau kapas harus ditambahkan
sebelumn bubur adsorben diaplikasikan.
Pasir dapat ditambahkan setelah aplikasi
bubur adsorben. Setelah aplikasi bubur
adsorben, kolom dibiarkan semalam.
Pada kromatografi gel, adsorben harus
direndam dalam fase gerak semalam agar
mengabsorpsi fase gerak dan mengembang.

2- Dry Packing:

Pada metode ini, adsorben kering dituangkan


langsung ke dalam kolom. Dilakukan vibrasi
untuk menghilangkan gelembung udara,
kemudian fase gerak dilewatkan melalui
adsorben. Metode ini tidak dapat digunakan
pada Kromatografi gel (permeasi gel/filtrasi
gel).

Fase gerak:

Berupa campuran pelarut organik (jarang digunakan


hanya satu pelarut). Pilihan fase gerak pada
kromatografi kolom didapat dari optimasi dengan KLT
dengan beberapa sistem pelarut. Sistem pelarut yang
baik harus menghasilkan nilai Rf kurang dari 0,6 untuk
semua bahan yang akan dipisahkan dengan
kromatografi kolom. Jika sistem pelarut membawa
komponen campuran lebih jauh dan menghasilkan
nilai Rf yang lebih besar, maka pemisahan pada
kromatografi kolom tidak akan terjadi. Sistem pelarut
yang tidak membawa bercak totolan sampel pada KLT
adalah sistem yang tidak bagus/cocok untuk
pemisahan dengan kromatografi kolom.

KLT untuk optimasi Kromatografi Kolom

Optimum: 0.2 < Rf < 0.5

Development technique

Isocratic elution
Gradient elution

Sistem Isokratik:

Artinya digunakan fase gerak yang sama sejak


dari awal hingga akhir pemisahan.
Sistem Gradien:

Polaritas sistem meningkat secara bertahap


selama pemisahan dengan cara meningkatkan
proporsi pelarut yang lebih polar. Sistem gradien
misalnya dimulai dengan CHCl3, diikuti dengan

campuran CHCl3/MeOH dengan peningkatan


secara bertahap % MeOH sampai semua
komponen terelusi dari sistem.

Kolom Monitoring:
Biasanya fraksi sejumlah volume tertentu yang
dikumpulkan kemudian diuapkan sehingga
volumenya lebih kecil. Kemudian ditotolkan
pada KLT. Fraksi yang mirip akan dikumpulkan
bersama untuk pemurnian atau kristalisasi..
Pada
monitoring
dengan
pengujian
hayati/bioassay,
fraksi
dimonitor
dengan
pengujian hayati kemudian dilakukan KLT.

Aplikasi Sampel
1. Wet application: Larutkan sampel dalam fase

gerak awal dan aplikasikan dengan pipet pada


ujung atas kolom. Metode ini sangat bagus,
tetapi dalam beberapa kasus, sampel yang
akan dipisahkan tidak larut dalam fase gerak
awal.

2. Dry loading:

Larutkan sampel dalam pelarut


yang volatil (mudah menguap). Larutan sampel
kemudian diadsorpsi pada sejumlah kecil
adsorben dan pelarut dibiarkan menguap.
Adsorben kering yang telah diloading dengan
sampel kemudian diaplikasikan ke dalam
kolom.

Konsep Teori
1- Migrasi Diferensial
Komponen yang berbeda bergerak melalui sistem
dengan kecepatan pergerakan yang berbeda
yang disebut migrasi diferensial". Kecepatan
beberapa komponen dalam campuran ditentukan
oleh jumlah molekul komponen tersebut dalam
fase gerak.

Misalnya kita memiliki campuran komponen A dan


B:
A: memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase gerak,
sehingga banyak molekul berada dalam fase gerak.
B: memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase diam,
sehingga sedikit molekul yang berada dalam fase gerak

StationaryPhase
Bs

As

A
Bm

MobilePhase

Am

Gambaran matematis dari


migrasi diferensial:
U:

kecepatan solven (fase gerak).

Ux: kecepatan komponen X.


R:

fraksi komponen X dalam fase gerak


Ux

UR

Jika R =

I maka semua molekul komponenberada


dalam fase gerak.
Ux = U X I
Ux = u
:. Maka, komponen X akan bergerak dengan
kecepatan fase gerak.
Jika R = 0.0 maka semua molekul komponen

berada dalam fase diam.


Ux = u x 0.0
:. Ux = 0.0
:.Maka, komponen X tidak akan bergerak sama sekali.
Sehingga,
komponen-komponen
yang
akan
dipisahkan melalui sistem harus terdistribusi
diantara fase gerak dan fase diam.

Capacity Factor (faktor kapasitas):


Faktor

yang mengatur distribusi beberapa


komponen diantara dua dua fase yang
berkompetisi disebut Distribution coefficient
atau Capacity factor
atau Mass
distribution ratio
K
(n)s
K =
(n)m
(n)s : jumlah mol komponen dalam fase diam
(n)m : total jumlah mol komponen dalam fase gerak

tr t 0
K =
t0
tr : waktu yang dibutuhkan oleh sampel melalui
kolom (retention time/waktu retensi).
t0 : waktu yang dibutuhkan oleh molekul solven
melalui kolom.
Nilai K yang lebih besar artinya komponen

tertahan lebih lama pada kolom (bergerak


lebih lambat).
Nilai K yang lebih kecil artinya komponen
bergerak lebih cepat.

2- Pergerakan komponen melalui sistem


kromatografi dalam bentuk zones atau bands:
Diasumsikan bahwa sistem kromatografi tersusun dari

sejumlah distribution systems atau equilibrations


yang disebut Theoretical Plates. Tiap theoretical
plate tersusun dari fase diam dan fase gerak. Tinggi
dari tiap lempeng disebut Height equivalent to
Theoretical Plate (HETP).
Jumlah lempeng teoritis N ini sangat penting untuk

pemisahan. Meningkatnya nilai N menghasilkan pita


yang lebih sempit dan pemisahan yang lebih baik.

L
N

=
HETP

L: Panjang kolom
N dapat ditingkatkan dengan :
1- Meningkatkan panjang kolom (tidak
praktis).
2- Menurunkan HETP.
Bagaimana menurunkan HETP:

Menurunkan ukuran partikel fase diam.


Pemilihan fase gerak yang lebih baik/cocok.

Kom ponen bergerak m elaluikolom sebagai


pita/bands atau zones dan kecepatannya diatur
oleh K'.
Kom ponen dengan K'= 1 (64 m olecules)
32
32

16
16
16
16

4
8

16

2
4

12
16

8
8

2
8

12
12

8
12

12

12
8

4
2

Komponen akan berada di tengah sistem dalam


bentuk pita. Jika kita meningkatkan N , komponen
akan lebih sempit. Pita yang lebih sempit akan
menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

2
2
8
8
12
12
8
8
2
2

N= 5

N= 25

A
B

N= 5

N= 150

N= 25

N= 150

Peak Resolution

Poor resolution

More separation

Less band spread

Faktor yang mempengaruhi


pemisahan:

Faktor fase diam:


1- Ukuran partikel : Ukuran partikel diperkecil akan
meningkatkan
luas
permukaan
dan
meningkatkan pemisahan. Namun, pengecilan
ukuran partikel akan menurunkan kecepatan alir
fase gerak

2- Aktivitas Adsorben

3- Paking kolom yang tidak seragam


4- Konsentrasi campuran

Faktor karena fase gerak


1- Pemilihan fase gerak yang tepat
2- Kecepatan alir fase gerak
3- Konsistensi kecepatan alir

Faktor Kolom
Dimensi Kolom
Temperatur kolom

Aplikasi
Separation
purification
Isolation of active constituents
clinical

Anda mungkin juga menyukai