METODE

METODE
A. Penentuan Kadar/Konsentrasi Protein
Konsentrasi Protein ditentukan menggunakan Bio-Rad protein
assay (Bio-Rad) dengan bovine serum albumin sebagai standarnya.
Bio-Rad molecular weight markers were used according to the
manufacturers' instructions. The protein bands were stained with
GelCode Blue (Pierce Chemical).
B. Pemisahan Protein
Menggunakan SDS-PAGE yang terdiri dari 12% polyacrylamide gel
dan 4% stacking gel.
Seluruh sampel dipersiapkan dengan merebus seluruhnya pada
suhu 100C f selama 5 min dalam 0.125 M Tris-HCl buffer, 4% SDS
(w/v), 20% glycerol (v/v), 0.1% bromophenol blue, and 10% 2mercaptoethanol (v/v).

Western Blot
Untuk memvisualisasi intracellular serta protein ekstraselular spesifik , Analisa
Western blot digunakan .
1. setelah electrophoresis gel dilakukan , buffer transfer dipersiapkan(per liter:
50 mL NuPAGE 20 x Transfer Buffer, 100 mL MeOH, 1 mL Antioxidant for
reduced samples; 250 mL per blotting chamber), dimana sponges and kertas
saring (Whatman 3mm Chr) direndam .
2. Membran nitroselulosa (BioRad Trans-Blot pure nitrocellulose membrane 0.2
m) diaplikasikan pada gel , yang disesuaikan dengan instruksi pabrik
3. chamber blotting diisi dengan buffer transfer. Blotting dimediasi oleh
tegangan 50 V selama 1 jam .
4. membran di blok dengan 25 mL larutan blok (1 x PBS, 0.1 % [v/v] Tween 20,
1% [w/v] susu skim ) selama 1 jam dan di cuci sebanyak 3 kali selama 10
menit menggunakan PBST yang diikuti inkubasi dengan antibodi -Antithrombin (Abcam, ab126598; 1:1000 dilutions) dalam 7 hingga 10 mL larutan
blok selama 1 jam atau semalaman.
5. Setelah itu di cuci sebanyak 3 kali selama 10 menit menggunakan PBST ,
diinkubasi dengan Goat Anti-rabbit antibody-HRP (Abcam, ab6721; 1:5000
dilutions, as instructed).