Anda di halaman 1dari 18

HPLC

KELOMPOK 4

Kristina
Santi
Endah
A worenes
Masni
Lia nilawaty
Desy
Utari
Mega salsabil
Widya murni

LATAR BELAKANG
Kromatografi merupakan suatu tekhnik analisis
biokimia berdasarkan pemisahan yang memerlukan
waktu relatif singkat dan tidak membutuhkan alat
yang rumit dibandingkan dengan metode pemisahan
lainnya.
Salah satu tekhnik pemisahan dan pemurnian suatu
bahan dapat dilakukan dengan menggunakan metode
kromatografi cair kinerja tinggi.

Kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) pada saat ini

merupakan metode kromatografi cair paling akhir


Dalam beberapa tahun terakhir ini teknologi KCKT dan
pemakaiannya

telah

sangat

berkembang

dan

walaupun mahal KCKT telah menjadi metode analisis


rutin dan bahkan preparatif pada banyak laboratorium
(Gritter, 1991).

Kromatografi cair kinerja tinggi (atau tekanan tinggi


kromatografi cair, HPLC) adalah bentuk spesifik dari
kromatografi kolom umumnya digunakan dalam
biokimia dan analisis untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan menghitung senyawa aktif
(Malviya, 2009).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah suatu
metode yang menggabungkan koefisien kolom dan
kecepatan analisis. Kromatografi ini dapat
memisahkan kandungan senyawa yang keatsiriannya
kecil. Semua tekhnik tersebut dapat digunaan pada
skala mikro maupun makro (Bintang, 2010)

KCKT digunakan untuk menentukan jumlah


senyawa yang spesifik dalam suatu larutan.
Sebagai contoh, HPLC dapat digunakan untuk
menentukan jumlah morfin dalam komponen
larutan (Kupiec, 2004). KCKT menggunakan kolom
yang memegang bahan kemasan (fase diam),
pompa yang bergerak (fase gerak) melalui kolom,
dan detektor yang menunjukkan waktu retensi
dari molekul.

waktu retensi bervariasi tergantung pada interaksi


antara fase diam, molekul yang dianalisis, dan
pelarut yang digunakan. Sampel yang akan
dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil dengan
aliran fase gerak dan perpindahan oleh bahan kimia
tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam.
Jumlah retardasi tergantung pada sifat dari analit
dan komposisi dari kedua fase stasioner dan mobile.

pelarut yang umum digunakan mencakup


kombinasi larut air atau cairan organik (yang paling
umum adalah metanol dan asetonitril). Pemisahan
telah dilakukan untuk beragam komposisi fase
mobile selama analisis ini dikenal sebagai elusi
gradien.

Jenis-Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang


umumnya digunakan dalam analisis adalah sebagai
berikut :
1. Kromatografi fase normal
2. Kromatografi fase terbalik
3. Kromatografi Eksklusi ukuran
4. Kromatografi pertukaran ion
5. Kromatografi bio-afinitas

Parameter KCKT analisis akurat dari senyawa, ada


beberapa parameter yang digunakan sebagai
standar untuk senyawa tertentu, Jika ada
perubahan terjadi dalam parameter hasilnya
mungkin akan sangat terpengaruh.
parameter yang paling umum digunakan adalah
diameter, ukuran partikel, ukuran pori, dan tekanan
pompa. Untuk senyawa yang berbeda parameter
dapat diubah sesuai dengan sifat fisika dan sifat
kimia.

Prinsip KCKT berdasarkan :


1. Retensi Retensi obat dengan kemasan yang
diberikan pasangan bahan dan eluen dapat
dinyatakan sebagai waktu retensi atau volume
retensi. Retensi atau volume elusi adalah
kuantitas fase gerak yang diperlukan untuk
menarik sampel melalui kolom
2. Resolusi Resolusi adalah kemampuan kolom untuk
memisahkan puncak pada kromatografi tersebut.
Resolusi (R) dinyatakan sebagai rasio jarak antara
dua puncak maximal dengan nilai rata-rata dari
puncak lebar di garis dasar.
3. Sensitivitas adalah ukuran dari tingkat terdeteksi
terkecil dari komponen dalam pemisahan
kromatografi dan tergantung pada signal ke rasio
dalam detektor diberikan.

Komponen utama KCKT

1. Reservoir dan fase gerak


Jenis dan komposisi fase gerak mempengaruhi pemisahan
komponen, pelarut yang berbeda digunakan untuk berbagai
jenis KCKT. Untuk fase-normal KCKT pelarut biasanya
nonpolar, dan dalam fase-balik KCKT pelarut biasanya
campuran air dan pelarut organik polar. Kemurnian pelarut
dan garam anorganik yang digunakan untuk membuat fase
gerak adalah yang terpenting.
2. Pompa
Pompa bertekanan tinggi yang diperlukan untuk mendorong
fase mobile melalui fase stasioner. Tekanan pompa stabil
(biasanya sekitar 1000-2000 psi) diperlukan untuk
memastikan reproduksibilitas dan akurasi. Pompa biasanya
dikenal kuat, tapi pemeliharaan yang memadai harus
dilakukan untuk menjaga karakteristik itu.

3. Injector
Injector bisa menjadi injeksi tunggal atau sistem
injeksi otomatis. Injektor untuk sistem KCKT harus
memberikan injeksi sampel cairan dalam kisaran
0,1-100 mL volume dengan reproduktifitas tinggi
dan di bawah tekanan tinggi (sampai 4000 psi).
Untuk kromatografi cair, sampel cair dapat
langsung disuntikkan dan sampel padat hanya perlu
untuk di- direkatkan dalam pelarut yang sesuai.
Cara memasukkan sampel ke dalam kolom KCKT
merupakan factor penting untuk mencapai
pemisahan yang sempurna.

4. Kolom
Kolom atau fase diam adalah inti dari setiap sistem
grafis chromatograph. Kolom yang tersedia secara
komersial berbeda panjangnya, ukuran dan bahan
kemasan. Penggunaan kombinasi yang benar,
panjang dan bahan kemasan di korelasi dengan
fase gerak yang tepat dapat membantu dalam
pemisahan paling efektif dari senyawa sampel.
Bahan kemasan yang paling banyak digunakan
untuk pemisahan HPLC adalah berbasis silika

5. Detektor
Ada berbagai jenis detektor yang dapat digunakan untuk
HPLC. detektor digunakan untuk mendeteksi adanya
senyawa yang melewati dan memberikan sinyal elektronik
ke perangkat akuisisi data. Jenis utama dari detektor yang
digunakan dalam HPLC adalah indeks bias (RI), ultraviolet
(UV-Vis) dan fluorescence, tetapi ada juga diode detektor
array, elektrokimia dan konduktivitas. Masing-masing
detektor memiliki aset, keterbatasan dan jenis sampel
yang paling efektif. Sebagian besar aplikasi dalam analisis
obat menggunakan detektor yang merespon penyerapan
radiasi ultraviolet (atau cahaya tampak) oleh zat terlarut
seperti itu melewati aliran-sel di dalam detektor.

6. Rekorder
Karena sinyal detektor elektronik, penggunaan teknik
akuisisi data modern dapat membantu dalam analisis
sinyal. Sistem akuisisi data dari kebanyakan sistem
KCKT adalah komputer. komputer mengintegrasikan
respon detektor untuk setiap komponen dan
menempatkannya ke dalam kromatografi yang mudah
untuk membaca dan menafsirkan. fitur yang lebih
canggih lainnya juga dapat dengan terapan sistem
kromatografi. Fitur-fitur ini termasuk injector otomatis
dikendalikan komputer, pengendali gradien multipompa dan kolektor fraksi sampel (Kupiec, 2004).

Kelebihan dan Kekurangan KCKT


Kelebihan KCKT (Johnson, 1991 dan Maryam, 2007)
Dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa seperti
mikotoksin secara terpisah, baik kuantitatif maupun
kualitatif dengan tingkat akurasi dan presisi, serta
spesifitas dan sensitivitas yang tinggi. Untuk
senyawa dengan sensitivitas rendah dapat
ditingkatkan melalui derivatisasi pra kolom atau
pasca kolom.
Cepat, daya pisahnya baik
Peka, detector unik
Kolom dapat dipakai kembali
Ideal untuk molekul besar dan ion
Mudah memperoleh kembali cuplikan.

Kekurangan KCKT (Maryam, 2007)


Membutuhkan proses preparasi yang lama dan
tingkat kemurnian sampel yang tinggi sehingga
dibutuhkan pemurnian (Cleanup).
Membutuhkan reagen dengan tingkat kemurnian
yang tinggi (HPLC grade)
Instrumentasi yang mahal
Membutuhkan operator yang terlatih.