SON LOS DIFERENTES

PROCEDIMIENTOS, QUE SE
USAN PARA MANTENER, EN LO
POSIBLE, EL ASPECTO DE LAS
ESTRUCTURAS HISTOLGICAS
DEL ORGANISMO
VIVO,TRANSFORMNDOLAS
EN DELGADOS CORTES
COLOREADOS QUE PUEDAN
POSTERIORMENTE SER
OBSERVADOS AL
MICROSCOPIO.. Es un proceso
largo que abarca desde el
momento en que se toma el
material hasta que el
preparado puede observarse.

METODOS MAS USADOS:

Las muestras para microscopia ptica deben

tener dos caractersticas:
Deben carecer de cpsulas que impidan o
dificulten la entrada del fijador y de los
solventes empleados.
Deben ser de pequeo tamao (cubos de
aproximadamente 5 mm de lado), para
permitir la entrada del fijador hasta el
centro de la muestra.

SE UTILIZA PARA :
Abolir el metabolismo celular.
Impedir la degradacin
enzimtica de las clulas y los
tejidos por autolisis (auto
digestin).
Destruir los microorganismos
patgenos como las
bacterias, los hongos o los
virus.
Endurecer el tejido como
consecuencia de la formacin
de enlaces cruzados o la
desnaturalizacin de las
molculas proteicas.

TIPOS FIJADORES
FISICOS
SIMPLES

FORMALINA.
ALCOHOL METLICO
BICLORURO DE
MERCURIO
TETRXIDO DE
OSMIO AL 1-2% P/V.
BICROMATO DE
POTASIO.
CIDO ACTICO.
ALCOHOL ETLICO.

COMPLEJOS

MEZCLA DE
BOUIN
Acido pcrico.
Formol.
cido actico.

LQUIDO DE
ZENKER
Bicromato.
Acido actico.
LQUIDO
DE HELLY
bicromato.
formol.

FRIO

DESECACION
- CALOR

2.DESHIDRATACION :
Luego de que la muestra ha sido
fijada se debe eliminar el fijador y
deshidratar. Para esto se utiliza
una serie gradual de soluciones
acuosas con una concentracin de
menor a mayor del agente
deshidratante, como por ejemplo
alcohol etlico. La deshidratacin
gradual se hace para evitar la
deformacin de la morfologa del
tejido, debido a la rpida salida
del agua.

3.-EL ACLARAMIENTO :

El aclarado, se utilizan solventes

orgnicos como xileno o tolueno, que son
miscibles tanto en alcohol como en
parafina, para extraer el alcohol al 100%
antes de la infiltracin de la muestra con
parafina fundida.

4.- INCLUSION :
ES LA FORMACIN DEL BLOQUE DE
PARAFINA (MEDIANTE LA INCLUSIN DEL
TEJIDO EN STA) RECIBIENDO EL NOMBRE
DE TACO

Primero una vez que ya est fijada

la muestra se procede a
deshidratarla.
Despus se coloca el tejido en un
recipiente para poder llenarlo con
parafina.
Se procede a esperar que se forme el
bloque.
Una vez formado el bloque se
encuentra listo para proceder a
cortar el tejido en el micrtomo.

5.- CORTE :
Los tacos de parafina que contienen
la muestra se cortan con un
instrumento denominado
micrtomo.
El micrtomo se asemeja a una
mquina de cortar fiambre; posee
una manivela que se gira
manualmente (tambin los hay
automticos) y que hace que la
pieza, donde se fija el taco, avance
automticamente apenas unos
pocos micrones y descienda sobre el
filo de la cuchilla para realizar la
seccin. Generalmente, las
secciones para microscopio ptico
tienen un espesor de 5 mm.

MICROTOMO :

CUCHILLAS
VIDRIO/
CORTES
FINOS
INSTRUMENT
O DE CORTE

CUCHILLAS
DIAMANTE/
CORTES
DUROS

UTILIZAN
CUCHILLAS

CUCHILLAS
ACERO/
TEJIDOS
BLANDOS

Luego se sumerge un portaobjeto

gelatinado o pre tratado con albmina
en el bao y, con ayuda de un pincel,
se ubica la seccin sobre la superficie
del portaobjeto mientras se eleva ste.
los portaobjetos con las secciones se
dejan secar a temperatura ambiente o
sobre una platina a 40 c para que las
secciones se adhieran a la superficie
del vidrio. Se puede llevar a la estufa
durante 15 a 20 a 80c.

5.- MONTAJE Y
TINCION :

Dado que los cortes en parafina son incoloros, la muestra todava no

est lista para su examen bajo el microscopio ptico. Para colorear o
teir los cortes histolgicos la parafina debe disolverse y extraerse,
de nuevo con xileno o tolueno, y los tejidos deben rehidratarse
mediante el uso de una serie de alcoholes de concentracin
decreciente. Luego el tejido colocado sobre los portaobjetos se tien .

A.-Proceso de
desparafinacin e
hidratacin realizados
en jarras de Coplin.
De izquierda a derecha
se pueden seguir los
distintos pasajes del
preparado histolgico
incluido en parafina
hasta su total
hidratacin.

DESHIDRATACION
Proceso de coloracin con
hematoxilina y eosina,

B.-Dado que las secciones

estn en un medio acuoso
durante la coloracin, es
necesario deshidratarlas
mediante pasajes en
alcoholes de graduacin
creciente (50, 70, 96 y
100) y luego sumergirlas en
xilol, el cual desplaza al
alcohol y permite la
penetracin del medio de
montaje.

MONTAJE :

Se aade una gota de blsamo de Canad o

de un medio de montaje sinttico (DPX o
Histomount) e inmediatamente se deposita
en el cubreobjeto , evitando la formacin de
burbujas de aire. Una vez que el medio de
montaje se solidifica, el preparado est listo
para su observacin al microscopio sin
riesgos de que se mueva el cubreobjeto. Los
preparados as montados duran dcadas y
pueden volver a observarse cuantas veces
sean necesarias. Los preparados forman
parte de los archivos de preparados
histolgicos que permiten hacer estudios
retrospectivos.

TINCION HEMATOXILINAEOSINA :
La hematoxilina es un colorante
catinico mientras que la eosina es
un colorante aninico
perteneciente a los xantenos. El
mtodo supone la aplicacin de la
tincin de hematoxilina, que por
ser catinica o bsica, tie
estructuras cidas (basofilas) en
tonos azul y prpura, como por
ejemplo los ncleos celulares; y el
uso de eosina que tie
componentes bsicos (acidofilas)
en tonos de color rosa, gracias a su
naturaleza aninica o cida, como
el citoplasma

FUNDAMENT
O

En los tejidos, los colorantes catinicos se unen a

las sustancias cidas que tienen cargas negativas,
es decir, a los cidos nucleicos (ADN y ARN). En
consecuencia, todos los ncleos de las clulas
tienen afinidad por los colorantes bsicos y decimos
que son basfilos (se tien de color azul violceo).
Las zonas de eucromatina son basfilas leves y las
zonas de cromatina condensada y los nuclolos son
intensamente basfilos.

En los tejidos, los colorantes aninicos se unen a las

sustancias que tienen cargas positivas, generalmente
a los grupos amino (-NH2) de las protenas. En
consecuencia, los citoplasmas de las clulas, dado
que poseen protenas, tienen generalmente afinidad
por los colorantes cidos, se tien de color rosado al
rojizo, y decimos que son acidfilos. La acidofilia o
eosinofilia puede ser mayor si encontramos en el
citoplasma un gran nmero de mitocondrias, dado
que sus membranas y su matriz son muy ricas en
protenas (poseen las enzimas de la cadena
respiratoria, del ciclo de Krebs y de la fosforilacin
oxidativa)

RESULTADOS
:

A) PIEL. En la parte superior se observa un epitelio

plano estratificado queratinizado. Los ncleos
celulares se observan basfilos, mientras que los
citoplasmas son eosinfilos. Hay un aumento de
la eosinofilia en los estratos superiores
(granuloso y crneo). El epitelio descansa sobre
tejido conectivo colgeno que muestra la
eosinofilia de las fibras de colgeno que
aumentan a medida que se alejan del epitelio.
B) TIROIDES. Folculos tiroideos. El epitelio cbico
simple muestra ncleos basfilos y citoplasmas
acidfilos. El centro de los folculos est ocupado
por un coloide constituido por la protena
tiroglobulina de tincin eosinfila.
C) MIOCARDIO. Las fibras musculares muestran sus
citoplasmas eosinfilos y se observan ncleos
basfilos de las fibras y del tejido conectivo.
D) TEJIDO ADIPOSO. Se observan los ncleos
basfilos de los adipocitos con un delgadsmo
citoplasma eosinfilo que es desplazado por una
gran gota de lpido que lo ocupa y que es
negativa con la tcnica porque los lpidos son
extrados del tejido por los solventes (alcohol y
xilol) durante el procesamiento.

TCNICA HISTOLGICA PARA LA

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE
TRANSMISION PASOS:
1.- TOMA DE MATERIAL : Las muestras de tejidos para
estudios ultraestructurales deben tener un tamao muy
pequeo, cubos de aproximadamente 1 o 2 mm de lado..
2.- FIJACIN : Las muestras se fijan con glutaraldehdo que
se diluye al 2,5 o 3% V/V en soluciones buffer o
amortiguadoras (fosfato o cacodilato) y se posfijan en
tetrxido de osmio.
3.- Deshidratacin : Al igual que en la microscopia ptica,
los bloques de tejido se deshidratan en concentraciones
crecientes de alcohol .

4.- Preparacin para la inclusin : luego se los pasa a

un solvente orgnico, que en este caso es el xido de
propileno .

5.- Inclusin : Se realiza en una resina tipo epoxi de

gran dureza (Epn 812, Durcupn o Westopal).
Estas resinas son semejantes a los pegamentos
comerciales que se usan cotidianamente para reparar
utensilios en el hogar .
6.- Modelado del bloque : Una vez que el tejido se
embebe en la mezcla de resina durante una noche,
los tacos se colocan en moldes de goma o de gelatina
con resina fresca y se polimerizan en una estufa de
inclusin a 60 C durante 48 h.

7.- CORTE : se realiza en

un equipo especial, el
ultramicrtomo que
utiliza cuchillas de vidrio
o de diamante y que
permite obtener desde
cortes semifinos (de 1
mm de espesor) hasta
cortes ultrafinos
plateados (de 70 nm de
espesor) de tejidos
incluidos en resinas tipo
epoxi.

B) NAVAJA DE
VIDRIO.

A) ULTRAMICRTOMO
C) EL TACO EN EL
SOPORTE, LA
NAVAJA QUE
REALIZA EL CORTE
Y LA FORMA DE
RECOGER EL CORTE
CON LA GRILLA.

Las secciones se
recogen sobre una
grilla metlica
que posee una
delicada malla fina de
cobre aunque
tambin puede ser de
nquel o de oro. La
grilla reemplaza al
portaobjeto de vidrio
de la microscopia
ptica.

CONTRASTECOLORACIN :
Las secciones se colorean
apoyando las grillas con las
secciones sobre gotas de acetato
de uranilo y citrato de plomo.
Estos metales pesados se
depositan en las estructuras
celulares y aumentan el peso
atmico de las estructuras
biolgicas que dispersan los
electrones en el MET. Las grillas,
una vez secas, estn listas para
su observacin al MET sin ningn
tratamiento adicional.

COLORACIN DEL CORTE PARA MICROSCOPIA ELECTRNICA. EL CORTE EST

SOBRE LA GRILLA Y, EN ESTE CASO, LA COLORACIN SE HACE APOYANDO LA
CARA DE LA GRILLA QUE SOSTIENE EL CORTE SOBRE GOTAS DE ACETATO DE
URANILO Y CITRATO DE PLOMO.

Fotomicrografa electrnica del citoplasma en el que se visualiza el RER

y el aparato de Golgi (G). Obsrvese que las cisternas del RER se
presentan con una disposicin paralela, interconectadas entre s. Se
puede distinguir perfectamente la luz cisternal del RER separada del
citoplasma, en el que hay abundantes polirribosomas libres formando
rosetas y ribosomas adosados a la cara citoslica de las membranas del
RER.

TCNICAS CITOQUMICAS E
HISTOQUMICAS

Se denomina as al conjunto
de tcnicas empleadas en
histologa que permiten
identificar y localizar de
forma especfica
componentes qumicos de
las clulas y los tejidos.

TECNICAS
CITTOQUIMICAS E
HISTOQUIMICAS

COLORACIN CON
EL REACTIVO DE
SCHIFF
COLORACIN DE
FEULGEN
COLORACIN DE
SUDN
TRICRMICO DE
MALLORY
TRICRMICOS DE
MASSON Y VAN
GIESON
TCNICAS
ENZIMTICAS
TCNICAS CLSICAS
PARA EL ESTUDIO DEL
SISTEMA NERVIOSO