FOTOMETER

YG28

DASAR DASAR FOTOMETRI

Fotometer : alat pengukur sinar.
Fotometri : pengkuran sinar.
Fotometris : cara pengukuran
berdasarkan pegukuran intensitas sinar
pada Panjang Gelombang Tertentu.
Sinar/cahaya : suatu gerakan
gelombang elektromagnetik.
=electro Manetic Radiation = EMR.
- Radiant energy = Energi Radiasi.
YG28

Panjang gelombang =
= jarak antara 2 puncak gelombang
= jarak antara 2 lembah gelombang
Satuan
:
o
Angstom
= A
= 10-10 m
Nanometer = nm/millimicron = m = 10-9 m
Micrometer = micron
= = 10-6 m
= ciri khas suatu sinar
YG28

Sinar monokhromatis :
- Terdiri dari 1 sinar
- Panjang geombang tertentu
Sinar polikhromatis :
Kumpulan sinar monokhromatis dengan bermacam-macam

YG28

Elektromagnetic Radiation Characteristic

Wave length interval, where the type of EMR begins

rays rays

u.v. visibl I.R

e

180
0

3400

700
0

180

340

700

10

nm/m

Penting dalam kimia klinis :

Cm
- u.v
- visible(=nyata)

YG28

0.7

Micr
o
wav
e

Radi
o
wav
e

400
0.04

25

Sinar Nyata :
Merah
Orange
Kuning
Hijau
BESAR
Biru
Indigo
Violet

MAKIN

M,O,K,H,B,I,V
YG28

uv, visible and short IR spectrum characterist

Wavelength
(nm)

Region name

Colour
observed

<380

Ultra violet

Not Visible

380-440

Visible

Violet

440-500

Visible

Blue

500-580

Visible

Green

580-600

Visible

Yellow

600-620

Visible

Orange

620-750

Visible

Red

750-2000

Short IR

Not visible

Coulour and complementary colours of the u.v. And visible spectrum

YG28

Prinsip pengukuran fotometris

Bila pada larutan suatu zat dengan ketebalan tertentu
dilewatkan sinar/cahaya monokhromatis, maka sebagian sinar
tersebut akan diabsorpsi oleh larutan itu
Banyak sinar yang terabsorpsi, tergantung darikonsentrasi zat
dalam larutan.

Io

I
Lar. X

Io = incident light
intensitas cahaya yang
datang
A = cahaya yang diabsorpsi
I = transmitted light
intensitas cahaya setelah
melewati lar X
b = jarak / tebal arutan yang
dilewati sinar
A( = Absorbance ) = E (exitintion) =
(O.D Optical Dencity)
I/Io=
YG28 T(Transmission)
..........% T

A
A max

A1

A2

YG28

YG28

YG28

YG28

BAGAN FOTOMETER
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Light source
Cermin / Lensa
Entrance Slit
Monochromator
Exit Slit
Cuvette
Detector
Meter
YG28

KETERANGAN
Light source
Tungsten lamp
Halogen lamp
Mercury lamp
Hydrogen lamp

Monochromator
Filter
Garating/kisi
Prisma

Pada
spectrophotometer
YG28

 Cuvette
Bentuk : bulat
bujur sangkar
segi-4 panjang
Bahan :
glass
silica/quartz
plastic

Detector
Barier layer cells
Protomultiplier Tube
YG28

 Meter = readout devices

Direct reading : output photo cell
Langsung ke meter
Digital readout devices
Absorbance ----> concentration

YG28

Hg-Line spectrume
= Spectrum garis dari
lampu Hg

YG28

Spectrum kontinu dari lampu

wolffram/tungsten

YG28

Filter Fotometer

YG28

Spectraline-fotometer

YG28

Spectro fotometer

YG28

BEERS LAW (Hk. Beer)

Dimana : A = absorbance
a = absorptivity
b = tebal lar. Yg dilalui sinar (cm)
tebal cuvette
c = concentrasi zat dalam. Lar.
%T = percent transmittance dimana T=I/Io
YG28

NAMA

SYMBOL

DEFINITION

Absorbance

-Log T = Log Io/I

Absorptivity

A/bc (c in g/L)

Molarabsorptivity

A/bc (c in mol/L)

Path length

Internal cell = sampel length in cm

Transmittunce

I/Io

Wavelength unit

nm

M = 10A = 10-9 m

Absorbstion max

Max

Wavelength at which max

absorption occurs

B = 1 cm
A=A1%
C =1 g/dl (1% )
1 cm
E=E1%
1 cm

= Absorption coef.
= Extinction coef.
YG28

Grafik I : Hub : % T - Concertration

Grafik II : Hub : A - Concentration
Gambar III : Skala hubungan A - % T
YG28

Perhitungan Konsntrasi
Hukum Beer : A1/A2 = C1/C2
Kalkulator Transmisi Konsentrasi
Kurva Kalibrasi

YG28

Syarat Hk. Beer :

1. Sinar monokhromatis : maks
2. Konsentrasi tidak extreem
(tidak terlalu encer/terlalu pekat) : 20
70 % T
3. Tidak berfluoresensi
4. Pengukuran dilakukan pada range
(jarak) konsentrasi yang tidak terlalu
besar
YG28

NEPHELOMETRY
Sinar yang disebarkan oleh partikelpartikel dalam suspensi diukur pada
posisi yang membentuk sudut tertentu
dengan arah sinar datang pada kuvet

YG28

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Countrolled intensity light source (sumber chy)

Filter
Kuvet
Detector
Multiplier
Display
YG28

1. Filter : red filter

2. Dua detector
3. Larutan kalibrasi : lar. Koloid yang
diketahui
4. Kurva kalibrasi tidak linier (p.u.)
di buat grafik periodik

YG28

YG28

TURBIDIMETRY
Pengukuran turbidometry :
menentukan banyaknya sinar yang
diblokir oleh partikel-partikel dalam
suatu suspensi
Cara :
mengukur sinar yang lewat kuvet
Alat :
foto meter / Spektrofotometer
YG28

Faktor berpengaruh :
1.
2.
3.
4.
5.

Juml. Partikel
Diameter partikel
Ukuran partikel
Waktu
Partikel
pada waktu pengukuran
4) & 5) Penambahan suspender : - G.A
- Gelatin

Pemeriksaan :
- TTT
- ZnSO4 TT = kunkel test
GA = Gummi Arabicum
YG28

Fluorometry
Fluorescence = energy emission (= energi
emisi)

Energi *< Energi A

sinar * > sinar A
Proses : 10-8 - 10-4 sec
Proses > 10-4 sec : Proses phosphorescence
YG28

YG28

BAGAN FLUOROMETER

1.Sumber energi
2.Entrance slit
3.Monochromator (prim
4.Cuvette
5.Monochoromator (sec
6.Exit slit
7.detector

YG28

FLAME FOTOMETER
Kalium = K+ (Potassium)
Natrium = Na+ (sodium)
Lithium = Li++
Magnesium = Mg++

YG28

Na:
Energi utama pada
Warna kuning
Li = merah
K = merah kebiruan
Mg = merah kebiruan
Ca = kuning kemerahan
Warna nyala = sifat khas
Yang dipilih :
- sentivitas tinggi
- pengaruh spektrum lain yang berdekatan : neg.
YG28

 Dalam keadaan konstan / tertentu,

intensitas pada tertentu yang di
hasilkanoleh atom logam = o atom
yang memancarkan energi
sebanding sebanding dengan Czat

YG28

YG28

KROMATOGRAFI
Pemisahan BM
TSW ETT : Pemisahan pigment tumbuh-tumbuhan
Prinsip dasar : pemisahan senyawa kimiia
berdasarkan BM dengan menggunakan sistem
solvent-substrate
Macam-macam kromatografi:
1. K. Kertas
2. K. Lapis tipis
3. K. Kolom (liquid column chromatografi)
4. K. Gas HPLC
1&2 tak perlu alat elektrik, kdg2 dgn optical
scanning.
YG28

K. KERTAS
K. Naik (ascending chromatografi)
K. Turun (desencing chromatografi)
Solvent
front
Grs sampel
YG28

K. Kertas :
Alat : 1. chamber/glass jar
2. standar
3. kertas kromatografi/kertas saring
4. solvent
5. spotter
6. penggaris
7. sistem pengamatan
YG28

PRINSIP K. KERTAS
Proses pemisahan o.k 2 gaya
yang berlawanan;

Gaya gravitasi
Gaya kapiler (capillary attraction)
Keterbtasan waktu:
Sebelum garis solvent mencapai
pinggiran kertas
YG28

PROSEDUR :
Isi chamber dgn solvent
Tertutup rapat, 15-30 menit
(jenuh dengan uap G. Kap max,

Penguapan min
Masukan k. Kromatografi yg sudah dispatt
dgn sampel. Posisi grs sampel diatas
permukaan solvent
Tertutup rapat, biarkan, amati,
angkat/hentikan sebelum grs solvent
mencapai pinggiran kertas chrom.
Keringkan.
Identifikasi dgn caraYG28
yg sesuai

IDENTIFIKASI
Rf=

jarak ditempuh fraksi

Jarak ditempuh solvent

Rf = - konstan untuk sistim solvent-substrat

tertentu
dpt dibandingkan dgn tabel.
- sampel kalibrasi/kontrol,>baik
Solvent::
substrat cocok untuk sampel, terutama camp H2O, Hac
dan suatu alkohol(butanol)
Khusus as2 amino dalam urine :
(L/alanin, L. Histidin, L. Leucin)
Butanol : Hac : H2O = 12 : 3 : 5
(perbandingan dpt bervariasi waktu/lama pengerjaan)
lama pengerjaan )
Umumnya H2O = 40% seluruh solvent
YG28

Kromatografi kertas 2 arah

=BilaTwo
dimentional
paper
= kromatografi kertas : hasil tidak sempurna
karena BM fraksi-fraksi = (spot merupakan garis)
chromatography
- Solvent kedua p.u. Nya 15% dalam H2O
Prosedur = k. kr. I
Diputar 90o
-Substrat
Kertas filter
Spesial/k. Kromatografi > baik
= daya kapiler lebih baik
-Bervariasi berat dan porositasnya
menentukan kecepatan proses pemisahan fraksifraksi.
YG28
Umum dipakai k. Kr. No
1.

Kromatografi lapis tipis

(thin
layer
chromatography
= TLC)
Prinsip
dasar
= k. Kertas
: fase diam dilapiskan pada plat
Gelas , metal/materi lain
Pelapis pada fase diam = adsorbents/sorbents :
Silica gel
Alumina
Microcrystaline cellulose

Sorbent terbaik :
Zat padat/kertas, titik leleh tinggi

Plat lapis tipis

Suspensi sorbent
Lapiskan/semprotkan pada plat.
Tebal 250 m (0,25 mm)
Aktifkan : kd. H2O min
YG28

Modifikasi :
1. Asam/basa/bufer ditambahkan pada
suspensi sorbent.
2. komposisi sorbent

SOLVENT TLC
Dipengaruhi oleh:
- macam elutropic ( dielektric constant
= = derajat kepolaran)
- TLC kekuatan elektrostratik relatif
solvent, substrat, sampel
- kekuatan penarikan berpariasi r
sebanding dengan komponen-komponen
campurannya.
- pemilihan solvent-sorbent = sistem
yang kompleks untuk
sampel tertentu.
YG28

- Laboratorium klinis K. Lapis tipis (TLC)

- Golongan lipid - phenol
- Steroid
- alkohol

Karbohidrat
- alkaloid
Glikosida - protein
Aldehid
- asam amino
Keton - senyawa amine
Obat-obat, vitamin, zat-zat toksis
YG28

Pengamatan TLC
p.u. karena terbentuk warna
A. Plat lapis tipiis siap pakai mengandung
ZnSO4 Iluminasi uv : ZnSO4
fluoresensi sedangkan fraksi-fraksi gelap
(sampel absorbansi uv).
B. Reagensia pewarna
1. Ninhydrin

Asam amino, protein, peptida, garam-garam

amino

2. Fluorescamine untuk amine primer, asam

amino kecuali proline dan hydrosiproline

Obat : amphetamin
Senyawa amin alifatik :

Etanolamin
Metil etil amin

YG28

YG28

TOXICOLOGY SYSTEM
= deteksi obat dalam urine = cara
cepat
-1.lapis
tipis
: silica gel (siap pakai)
untuk
barbiturat
- solvent
hanya
dibedakan
etil asetat
: metanol
: 28 %atas:
amonia :
H2O
= 85
: 13,5 :
1,0
: 0,5
- Develoment dan heating: idem
- Pewarna: iodoplatinate
# - persiapan sampel kompleks.
- perlu pH tertentu.
YG28

YG28