SISTEMAS DE EXPRESIN

PARA PROTENAS
TERAPUTICAS
RECOMBINANTES
FARMACOLOGA MOLECULAR

INTEGRANTES:
Anaya Caceres Joselyn
Cabezas Huatuco Gerardo
Gonzales Espinoza Sarai

SISTEMA DE EXPRESION EN
BACTERIAS
La
recombinacin
de genes
humanos en el
ADN de bacterias
es una de las
posibilidades que
ofrece la
biotecnologa.
Esta tcnica es
de gran valor
porque las
bacterias se
reproducen
rpidamente y
pueden duplicar
su nmero cada
20 minutos.

Por ejemplo,
insulina humana
obtenida a partir
de la bacteria
Escherichia coli.

La produccin de
protenas
recombinantes
involucra las
siguientes
etapas:

Fermentacin
Extraccin
Purificacin
Formulacin

Para la expresin
de protenas no
glicosiladas
recombinantes
suele emplearse a
la E. coli.

Los
medios
sintticos facilitan
el aislamiento y
purificacin
del
producto y reducen
el costo de su
produccin.

El gen
Un origen de
replicacin
Un marcador de
seleccin
Un promotor
Un gen de
terminacin de
transcripcin

INSULINA
Si bien estos son los pasos a seguir para la obtencin de insulina
recombinante, si se inserta en el plsmido bacteriano el gen entero
de la insulina, se obtendra como resultado la preproinsulina. Para
evitar estas dificultades se sintetizan qumicamente la secuencia de
ADN correspondiente a las cadenas polipeptdicas A y B que se
insertan separadamente en un gen bacteriano. Los plsmidos
recombinantes se introducen en bacterias E. coli, donde se
multiplican. Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante
una reaccin que forma puentes disulfuro (de azufre) y se obtiene
insulina humana pura. El producto final, la insulina humana
biosinttica, es idntica en todos los aspectos a la insulina purificada
del pncreas humano.

Levadura
Los sistemas de expresin de protenas recombinantes basado en levaduras han demostrado ser una fuente
eficiente y econmica de protenas de eucariotas superiores de inters industrial yo acadmico. Las levadura
ofrecen un ambiente apto para el plegamiento de protenas eucariotas- llevan a cabo algunas modificaciones
postraduccionales y pueden secretar la protenas recombinantes al medio de cultivo. Adems las levaduras
mantienen las ventajas de los microorganismos de ser unicelulares, de fcil manipulacin y rpido
crecimiento. Por otro lado tiene una organizacin celular eucariota que permite la realizacin de procesos de
expresin y maduracin caractersticos de clulas animales y vegetales. Lo cual da ventaja para la produccin
de protenas de origien eucariota

Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae capaces de llevar a cabo la

N-glicosilacin (adicin de carbohidratos al grupo R del aminocido asparagina de la
protena) de protenas heterlogas. A pesar de la habilidad de las levaduras de glicosilar
protenas, la composicin de los azcares de estas glicoprotenas difiere de la protena
nativa de origen animal.

Limitaciones
Las glicoprotenas provenientes de levaduras pueden
tener una vida media baja debido a que al unirse a
receptores de manosa expresados en la superficie de
macrfagos, son captadas y eliminadas por estas clulas
fagocticas. Lo anterior ha limitado la aplicacin de
levaduras en sistemas de expresin de protenas
heterlogas humanas que no requieren ser glicosiladas.

Sistema de expresin en clulas de

insectos.
La caracterizacin del veneno de L. mactans mostr la
existencia de una familia de protenas relacionadas pero
selectivamente txicas para los vertebrados, insectos o
crustceos: -latrotoxina, -latroinsectotoxina y latrocrustatoxina, respectivamente.
La -latrotoxina (LTX) es la protena que afecta a los
vertebrados y est compuesta por una sola cadena
polipeptdica no glicosilada.
Para el antiveneno se utiliza la -latrotoxina de la especie
L. mactans de manera recombinante con el objetivo de
utilizarla como inmungeno sustituto del veneno en la

 Con el objetivo de expresarla de manera recombinante y utilizarla como un inmungeno

sustituto del veneno en la produccin del antiveneno Aracmyn .
Volynski y colaboradores (1999) reportaron la expresin de la LTX recombinante completa y
activa de L. tredecimguttatus utilizando el sistema de clulas de insecto baculovirus, por lo
que decidio utilizar este mismo sistema para expresar la LTX recombinante de L. mactans.
Para lograr este objetivo se parte de un plsmido obtenido en el laboratorio que tiene
insertada la secuencia codificante de la LTX madura, la cual se subclona en el vector
pMelBacA .

El vector pMelBacA-LTX fue cotransfectado a clulas de insecto Sf9 junto con ADN
de baculovirus y como resultado se obtiene 11 placas virales recombinantes aisladas,
amplificadas y tituladas.

Para la produccin de protenas glicosiladas humanas recombinantes se emplean cultivos

derivados de lneas celulares de mamferos como la lnea celular BHK (Baby Hamster Kidney),
HEK293 (Human embryonic kidney) y principalmente la lnea celular CHO (Chinese Hamster
Ovary). En trminos generales, los requerimientos bsicos de un vehculo de clonacin para
clulas eucariontes son: un promotor eucarintico generalmente de origen viral, que regule y
promueva la expresin del gen que codifica la protena de inters, un sitio de clonacin, una
secuencia de poliadenilacin, un origen bacteriano de replicacin y un marcador de seleccin. A
escala industrial los genes de seleccin ms populares son el gen que codifica la enzima glutamina
sintetasa (GS) y el gen que codifica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) implicada en el
metabolismo de nucletidos. Usualmente se adiciona un agente txico como el metotrexato (MTX)
frecuentemente empleado para seleccionar las clulas resistentes receptoras del gen de seleccin.

ANIMALES TRANSGNICOS
Se estn utilizando animales transgnicos que producen protenas recombinantes en la leche,
la clara de huevo, la sangre, la orina, el plasma e incluso en los capullos de seda. La idea
bsica es sencilla: aprovechar los mecanismos de produccin de estos fluidos para
incluir en los mismos la protena de inters, con la ventaja de una purificacin sencilla y
un bajo coste.
Por ejemplo: El uso de las glndulas mamarias para producir protenas en la leche.
Entre las protenas producidas podemos contar
activador tisular de plasmingeno (implicada en la disolucin de cogulos de
sangre) en leche de cabra
alfa-1-antitripsina (Protege a los tejidosde lasproteasaspresentes principalmente en
lasclulasinflamatorias, en especial laelastasa.) en leche de oveja
protena C (juega un papel importante regulando laanticuagulacion, inflamacion ,
muerte celular y manteniendo la permeabilidad de las paredes de losvasos
sanguneos) humana en leche de cerdo.

PLANTAS TRANSGNICAS
Las plantas, en comparacin con los animales y los cultivos
procedentes de animales, ofrecen una produccin ms segura y
rpida, que requiere menos tiempo y es ms ventajosa en trminos
de almacenamiento y distribucin. En cuanto a seguridad, presentan
menos riesgo de contaminacin con patgenos animales, ya que no
son infectadas por virus animales y los virus vegetales a su
vez no son transmisibles al ser humano.
Productos que se han producido con xito son
beta-D-glucuronidasa (enzimas que degradan carbohidratos
complejos)
tripsina(enzima peptidasa, digestiva, hidrolisis de proteinas)

Control de biofrmacos aprobados

para su distribucin comercia
Cumplir las normas basadas en las buenas
prcticas de manufactura (Good Manufacturing
Practice, GMP) de biofrmacos.
Dichas normas son acordadas por organismos
como EMEA (The European Medicines Evaluation
Agency) el CDER (Center for Drug Evaluation and
Research del U.S. Food and Drug Administration,
FDA)

 r, recombinant
(recombinante)
rh, recombinant human
(humana recombinante)
E. coli (Escherichia coli)
CHO, Chinese hamster
ovary
BHK, baby hamster
kidney
hGH, human growth
hormone (hormona
humana de crecimiento)
FSH, follicle stimulating
hormone (hormona
foliculo estimulante)
TSH, thyroid stimulating
hormone (hormona
estimulante de tiroides)
IFN, interferon; PDGF,
platelet derived growth
factor (factor de
crecimiento derivado de
plaquetas).