Golden Crops For Human

Nutrition
Oleh :
Andang Syarifudin
Denny Muhammad F.
Dwiana Muflihah Y.
Nur Siti Kurniasih
Tanjung Ardo

Pendahulua
n
Tanaman transgenik (GMO) berkembang pesat
Sejak tahun 1996 tercatat 1,7 juta hektar lahan digunakan untuk menanam
tanaman transgenik => thn 2009, menjadi 134 juta hektar yang melibatkan
14 juta petani di 25 negara termasuk 16 negara berkembang.
Mayoritas tujuan awal dari tanaman transgenik generasi 1 =>
toleransi terhadap herbisida dan resistensi terhadap hama
serangga
Tanaman transgenik generasi 2 => Tanaman yang diperkaya dengan
mikronutrien (mis. Beta karoten/vitamin A).
Defisiensi vitamin A merupakan salah satu masalah kekurangan mikronutrien
yang dialami oleh 250 juta penduduk dunia dan merupakan defisiensi nutrisi
yang paling sering ditemukan di negara berkembang. => tanaman transgenik
dengan kadar provitamin A tinggi untuk memenuhi kebutuhan vitamin A yang
disebut Golden Crops, antara lain golden rice, golden maize dan golden
banana.

 Padi tidak memproduksi karotenoid,

tetapi memiliki kemampuan
mem-produksi prekursor karotenoid

Padi Emas
(Golden Rice)

= Geranylgeranyl diphosphate
GGDP
Oleh :
Phytoene
desaturase
Beta-karoten
desaturase
phytoene synthase
lycopene-cyclase.

Penghambatan fungsi
enzim phytoene
synthase (PHY)
menghambat
pengubahan
phytoene dari GGDP
(precursor langsung
dari karoten pada
tumbuhan )
pengkode oleh gen phy

pengkode oleh gen lcy

Katalis
pembawa 2
ikatan rangkap

 Gen Phy Tanaman Daffodil

(bakung) enzim phytoene synthase
(PHY)mengubah GGDP menjadi
Phytoene
Gen crt1 bakteri tanah Erwinia
enzim phytoene
desaturasemengubah phytoene
menjadi lycopene
Enzim lycopene cyclase
(LYC)mengubah lycopene menjadi
beta-karoten Gen pengkode
phytoene synthase GR1 diisolasi dari
tanaman Daffodil, GR2 diisolasi dari
sejenis jagung

Padi Emas
(Golden Rice)

Padi Emas
(Golden Rice)
Padi emas 2 menggunakan gen
yang sama pada padi emas 1,
begitu juga enzim pengkode yang
memiliki aktivitas yang sama.
Asal isolasi gen pengkode phytoene
synthase : -padi emas 2 diisolasi
dari sejenis jagung,
-padi emas 1 diisolasi dari daffodil
(Narcissus pseudonareissus)

Padi Emas
(Golden Rice)

media transformasi (vector) yang

digunakan untuk membawa DNA
target kedalam padi =
Agrobacterium Tumefaciens
Marker = E. coli phosphomannose
isomerase
metode identifikasi awal
menggunakan single kopi dari DNA
transfer = Metode polymerase
chain reaction (PCR)

Padi Emas
(Golden Rice)

Konstruksi DNA vektor pada padi , tersusun atas :

a.Glu: riceglutelin Glut01 (Glu) promoter (nucleotides
1568--2406)
b.SSUcrtl: functional fusion of the pea RUBISCO small
subunit plastid transit peptide with Erwinia uredovora
crtI D90087
c.Terminator regions of A. tumefaciens nos (nucleotides
18482100, V00087).
d.Zea mays phytoene synthase (psy) Zea Mays
polyubiquitin Ubi1 promoter with intron E. coli
phospho-mannose isomerase (PMI) selectable marker.

Padi Emas
(Golden Rice)

Keluaran
dari
penelitian
ini
adalah
endosperm padi emas dengan 3 gen yaitu
yang memproduksi beta-karoten, sehingga
berwarna kuning, lebih kuning daripada padi
konvensional.
teknik
rekayasa
genetika
yang
memanfaatkan sambungan DNA dari bakteri
tanah (Erwinia uredovora) dan tumbuhan
Bakung daffodil (Narcissus pseudonarcissus)
ke dalam padi Oryza sativa.

Padi Emas
(Golden Rice)
Padi emas 2 merupakan tahapan lebih tinggi dari padi emas 1, secara
nama bulir padi tersebut mengandung precursor vitamin A yang lebih
tinggi. analisa fotometrik dengan menggunakan HPLC (highperformance liquid chromatography) yang menunjukkan adanya
karotenoid, termasuk beta-karoten, Proyek padi emas 2 menghasilkan
kenaikan karoteniod total yang lebih tinggi sekitar 80% (10 to 40
g/g berat kering) dibandingkan dengan padi konvensional ataupun
padi emas 1.

Padi biasa

Padi emas 1

Padi emas 2

Jagung yang mengandung pro-vit A.

Jagung Emas
(Gold Maize)

Cara???
mengekspresikangen gen crtB dan rctL Erwinia
herbicola pada tanaman jagung.

metode

Jagung Emas
(Gold Maize)

Vektor : Plasmid pRC4

1. rbcS TP-crtB gene diamplifikasi dengan primer CRTB-For: 5CCCACATGTCTTCTATGATATCCTCTTCCG-3 and CRTB-Rev: 5CAGCTATGACCATGATTACGC-3. Di insersi pada pRC4 : plasmid
pRB.
2. rbcS TP-crtI gen diamplifikasi dengan primers CRTI-For: 5
CATGCCATGGCTTCTATGATATCCTCTTC-3 and CRTI-Rev.
diinsersi pRC4: plasmid pRI
3. Plasmids pRBS and pRIS, diperoleh dengan memodifikasi
promoter p-zein pada promoter ini terjadi duplikasi pada
region -444/-174 First. Fragmen promotor ini disisipkan
pada pRB dan pRI dengan menggunakan HindIII

Konstruksi plasmid
rekombinan

Jagung Emas
(Gold Maize)

Transformasi dan seleksi

plasmid rekombinan

Jagung Emas
(Gold Maize)

Transformasi : embrio jagung yang belum matang (Hi-II).

microprojectile bombardment dengan menggunakan
PDS 1000/he biolistic gun
Seleksi plasmid rekombinan didasarkan resisten terhadap
herbisida (bialaphos). Kromosom DNA dari kalus yang
resisten kemudian dikonfirmasi dengan menggunakan
analisis PCR.

Regenerasi tanaman
jagung

Jagung Emas
(Gold Maize)

Plantlet: ditanaman pda media pertumbuhan di greenhouse.

T0 vs polen
hi-II

T1

Korotenoid
??

Analisis
Biji tanaman T1 diekstraksi dan dianalisis dengan HPLC
mengggunakan Empower Pro software Version 1.

Hasil analisi karotenoid

T1 yang diperoleh dari transformasi gen crtB dan crtI
dibawah kendali promotor c-zein memiliki biji yang
berwarna putih dan tidak terdeteksi adanya karotenoid.
T1 yang berisi gen crtB dan crTI dibawah kontrol
promotor sp-zein terjadi peningkatan jumlah karotenoid
dengan akumulasi provitamin A pada endosperma
jagung yang lebih tinggi bila di bandingkan dengan
jagung Hi-II. Selain itu, T1 lebih banyak mengandung biji
yang berwarna kuning bila dibandingkan dengan jagung
Hi-II.

Tahapan penelitian
1.Kontruksi Vektor

Pisang Emas
(Golden Banana)

Segmen pengkode :
Phytoene synthase 2a dari Musa
troglodytarum x acuminata kultivar
Asupina (MtPsy2a),
Phytoene synthase 1 dari Zea mays
kultivar B73 (ZmPsy1)
Phytoene desaturase dari Pantoea
ananatis (PaCrtl),
Fungsi :
Sebagai gen yang
memfasilitasi peningkatan
kandungan provitamin A pada
pisang

Tahapan penelitian
1.Kontruksi Vektor

Pisang Emas
(Golden Banana)

Gen uidA dari Escherichia coli yang

mengkode -glucuronidase

Fungsi :
untuk menguji kinerja promoter

Tahapan penelitian

Pisang Emas
(Golden Banana)

1.Kontruksi Vektor
Segmen pengkode :
Phytoene synthase 2a
(MtPsy2a)
Phytoene synthase 1(ZmPsy1)
Phytoene desaturase (PaCrtl)

Gen uidA

Difusik
an
Oleh :

noplaline synthase
(Nos)
urutan pengatur
terminasi transkripsi dari
Agrobacterium
tumefaciens.

Tahapan penelitian
1.Kontruksi Vektor

Pisang Emas
(Golden Banana)

Terdapat 3 promoter yang digunakan untuk

mengekspresikan gen yang berhubungan dengan
produksi provitamin A pada buah pisang
membentuk susunan :
Exp1-uidA-nos
ACO-uidA-nos
Ubi-uidA-nos
(semuanya akan
diintegrasikan ke dalam
plasmid pBIN-19.)

constitutive maize
polyubiquitin
promoter (Ubi)
Diuji
dengan
gen uidA

Expansin 1
promoter (Exp1)
(dari Pisang)
ACC oxidase
promoter (ACO)
( dari Pisang)

Tahapan penelitian
1.Kontruksi Vektor

Pisang Emas
(Golden Banana)

Terdapat 3 promoter yang digunakan untuk

mengekspresikan gen yang berhubungan dengan
produksi provitamin A pada buah pisang

juga digunakan untuk meregulasi

ekpresi :
MtPsy2a dan ZmPsy1
membentuk 6 susunan ekspresi
yang diintegrasikan pada plasmid
pCAMBIA-2300

constitutive maize
polyubiquitin
promoter (Ubi)
Expansin 1
promoter (Exp1)
(dari Pisang)
ACC oxidase
promoter (ACO)
( dari Pisang)

Tahapan penelitian
1.Kontruksi Vektor

Pisang Emas
(Golden Banana)

Gen PaCrtl diekspresikan dengan promoter Ubi dan

Exp1 membentuk susunan Ubi-PaCtrl-nos dan
Exp1-PaCtrl-nos yang diintegrasikan pada plasmid
pBIN-19.
Seleksi tanaman transgenik dimediasi dengan gen
neomycin transferase II pada kedua plasmid
pCAMBIA-2300 dan pBIN-19

Tahapan penelitian
2.Transformasi dan
regenerasi tumbuhan

Pisang Emas
(Golden Banana)

Musa acuminata kelompok AAA (Dwarf Cavendish)

digunakan sebagai tanaman inang dimediasi
menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain
AGL1
Vektor yang membawa MtPsy2a atau ZmPsy1
digunakan untuk mentransformasi suspensi sel
embrionik pisang baik secara individual atau
kombinasi dengan vektor yang membawa PaCrtl.
Vektor-vektor yang membawa gen
uidA digunakan keseluruhan
digunakan secara individual
untuk transformasi.

Tahapan penelitian

3.Perbanyakan dan uji

lahan

Pisang Emas
(Golden Banana)

Pisang transgenik dan wild type diperbanyak dengan

kultur jaringan kemudian dipindahkan ke lahan uji
Tanaman diaklimatisasi dengan keadaan tanah dan
ditanam pada glasshouse selama 12 minggu sebelum
ditanam pada lahan terbuka sesuai dengan standar
prosedur agronomik.

Tahapan penelitian
4. Pengambilan dan
pemrosesan sampel

Pisang Emas
(Golden Banana)

Buah pisang yang sudah matang tetapi masih berwarna

hijau (full green-FG) dipanen => diproses pada cahaya
rendah dengan perlakuan paparan ethylene selama 7 hari
untuk memperoleh buah yang matang penuh (full ripe-FR).
Buah pisang pada bagian atas, tengah dan bawah
tandan => untuk menguji tanaman yang membawa gen
Psy atau Crtl.
tanaman yang membawa gen
uidA
=> hanya diambil buahnya pada
bagian atas tandan.

Tahapan penelitian
4. Pengambilan dan
pemrosesan sampel

Pisang Emas
(Golden Banana)

Sampel daun = > daun yang mengalami perluasan penuh

sebelum munculnya tandan pisang.
Kemudian dibeku-keringkan (freeze-dried) dan
dihomogenisasi untuk analisis lebih lanjut.

5. Isolasi
DNA

DNA genomik diisolasi dari 50

mg sampel daun yang telah
dibeku-keringkan

dihomogenisa
si untuk PCR
Analisis analisis
Southern blot
melalui metode
modifikasi CTAB

Tahapan penelitian
5.Isolasi DNA

Pisang Emas
(Golden Banana)

Total RNA diekstrasi dari 50 mg

sampel jaringan buah yang
telah dibeku-keringkan

6.Perlakuan
dengan DNAase & sintesis
cDNA

dihomogenisasi sesuai
dengan deskripsi
Valderrama-Chairez et
al.(2002).

3 g dari total RNA diberi

perlakaun dengan DNA-ase

RNA murni (1,8 g) diberi

perlakuan dengan reverse
transcriptase untuk
membentuk cDNA

Tahapan penelitian
7. PCR & RTPCR

Pisang Emas
(Golden Banana)

Sampel diuji pada kondisi standar PCR dengan primer

oligonukleotida yang didesain untuk mengamplifikasi
fragmen gen MtPsy2a, ZmPsy1 dan PaCrtl.
Tanaman transgenik yang positif => diuji lanjut dengan PCR
untuk mendeteksi keberadaan kontaminasi
Agrobacterium menggunakan primer gen VirC
cDNA dari tanaman transgenik
yang positif selanjutnya
digunakan dalam RT-PCR untuk
memverifikasi ekspresi gen.

Tahapan penelitian
8. Quantitative real time
PCR
aktivasi polymerase pada suhu
95 oC selama 2 menit

Pisang Emas
(Golden Banana)
s denaturasi pada suhu
yang sama
annealing dan ekstensi
pada suhu 60 oC

Pada akhir reaksi kurva

disosiasi dihasilkan dari
suhu 65-95 oC untuk
mengkonfirmasi spesifitas
amplikon dari masingmasing set primer

Tahapan penelitian
9. Southern Blot

Pisang Emas
(Golden Banana)

DNA genomik dan kontrol positif plasmid DNA diperlakukan

dengan enzim restriksi** pada suhu inkubasi 37 oC

DNA yang telah terdigesti dengan enzim restriksi selanjutnya

dielektroporesis, diblot dan dideteksi sesuai kondisi standar
prosedur Shouthern blotting

Keterangan :
** = Enzim restriksi yang dipilih hanya
mampu memotong DNA pada segmen
yang tidak berhibridisasi dengan probe.
Probe didesain untuk menarget gen
MtPsy2a dan ZmPsy1

Tahapan penelitian
10.Kuantifikasi
kandungan
karotenoid

Pisang Emas
(Golden Banana)

Karotenoid diekstraksi dari jaringan buah dan dianalisis

menggunakan HPLC
Total karotenoid dan -karoten ekuivalen (-CE) diukur
dengan satuan g/g berat kering (dry weight-dw).

11.Pengukuran aktivitas
promoter

-glucuronidase (GUS) diukur pada jaringan buah dengan

ELISA, sedangkan pada daun dan kulit buah diukur dengan
fluorometric quantitification.

Hasil penelitian

Pisang Emas
(Golden Banana)

Ekspresi dari gen MtPsy2a meningkatkan kandungan -CE

mencapai 55 g/mg berat kering.
ekspresi dari gen ZmPsy1 meningkatkan kandungan
provitamin A pada buah pisang walaupun tidak
menunjukkan ekspresi fenotip yang diinginkan.
Penggunaan promoter Ubi untuk MtPsy2a dan ZmPsy1
meningkatkan akumulasi provitamin A pada tahapan awal
perkembangan buah, sedangkan penggunaan promoter ACO
dan Exp1 membatasi akumulasi provitamin A pada tahap
akhir perkembangan buah
Aktivasi awal dari rate-limiting
enzyme pada jalur biosintesis
karotenoid dan pemanjangan durasi
maturasi buah merupakan faktor yang
esensial untuk menghasilkan
kandungan provitamin A yang optimal

TERIMA KASIH