mengeksploitasi potensi genetik tanaman untuk memaksimumkan
ekspresi gen dari potensi genetik tanaman pada suatu lingkungan tertentu (Stoskopf et al., 1993).
Tujuan pemuliaan tanaman adalah memaksimalkan potensi genetik
tanaman melalui perakitan kutivar unggul baru yang berdaya hasil dan berkualitas tinggi, resisten terhadap kendala biotik dan abiotik (Mayo, 1980).
Apa itu Marka Molekuler?
Marka Molekuler yaitu Penanda genetik atau penciri individu yang terdeteksi dengan alat tertentu yang menunjukkan genotipe suatu individu.
Bentuk
Marka
Molekuler :
Berupa penampilan fenotipe/morfologi tertentu
Kandungan senyawa (protein atau produk biokimia tertentu)
Berkas (band) pada suatu lembar hasil elektroforesis gel atau kromatogram, atau hasil pembacaan sekuensing.
Jenis Marka Molekuler
1. PCR (Polymerase Chain Reaction) Suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi/memperbesar/melipat gandakan suatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro.
Teknik PCR biasanya memiliki sensivitas yang sangat tinggi,
sehingga kontaminasi sampel DNA dapat mempengaruhi hasil analisis. 1.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Prinsip kerja dari RAPD yaitu semua pita DNA yang berukuran sama hasil dari amplifikasi dapat dikelompokkan menjadi satu tanpa perlu mengetahui urutan DNAnya.
Jenis Marka Molekuler
Kelebihan RAPD
dari
teknik
analisa
-Pelaksanaannya lebih cepat
-Hanya membutuhkan sampel DNA dalam jumlah sedikit (0,5-50 nm) -Tidak membutuhkan radioisotope -RAPD tidak membutuhkan informasi sekuen DNA lebih dulu dan prosedurnya lebih sederhana, lebih cepat, lebih murah daripada RFLP.
-Tidak dapat membedakan individu homozigot dan heterozigot
karena bersifat sebagai penanda dominan -Sulit mendeteksi perubahan yang kecil pada struktur DNA (gen), kecuali jika menggunakan lebih dari 500 jenis primer -Polymorphismenya rendah, reproducibility rendah (dapat diperbaiki dengan emphasized RAPD dengan menambah nucleotide (A,T,G, atau C) pada ujung 3 pada primer yang asli.
Kelemahan RAPD
dari
teknik
Jenis Marka Molekuler
Contoh kasus pada tanaman teh :
Penggunaan RAPD untuk identifikasi gen ketahanan tanaman teh
terhadap
penyakit
cacar
daun.
Penanda
RAPD
dapat
digunakan sebagai alat bantu seleksi secara tidak langsung dalam
seleksi klon teh yang tahan terhadap penyakit cacar apabila terdapat pautan yang kuat antara penanda RAPD dengan gen pengendali karakter ketahanan dalam kromosom (Burr, 1994).
Jenis Marka Molekuler 1.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Pada dasarnya AFLP merupakan gabungan dari teknik RLFP dan teknik PCR, dikembangkan pertama kali oleh Vost et al. pada tahun 1995. Prinsipnya dengan mendeteksi perbedaan letak marka DNA di seluruh genom yang berupa urutan basa tertentu.
Jenis Marka Molekuler
Keunggulan teknik AFLP menurut Vos et al. (1995)
Tidak memerlukan informasi sekuen dari genom dan perangkat (kit)
oligonukleotida yang sama ketika dilakukan analisis dan dapat diaplikasikan pada semua spesies tanaman, hasil amplifikasinya stabil
Tingkat pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi
Memiliki efisiensi yang sangat tinggi dalam pemetaan lokus, karena sekali amplifikasi dapat meliputi beberapa lokus
Dapat digunakan untuk menganalisis sidik jari semua DNA dengan
mengabaikan kompleksitas dan asal usulnya
Dapat bertindak sebagai jembatan antara peta genetik dan peta fisik pada kromosom
Jumlah lokus yang diperoleh dari setiap reaksi lebih banyak, hal ini disebabkan karena penggunaan primer PCR yang lebih panjang sehingga memungkinkan dilakukannya reaksi pada suhu yang tinggi
Jenis Marka Molekuler
Kelemahan AFLP
dari
teknik Cara aplikasinya relatif lebih rumit, sehingga memerlukan waktu lebih lama, keterampilan khusus, serta pengadaan alat dan bahan sangat mahal. Teknik ini sedikit rumit karena melibatkan enzim restriksi dan amplifikasi.
Prosedur AFLP lebih banyak membutuhkan tenaga dan lebih mahal daripada analisis RAPD, Marka AFLP mirip dengan RAPD, tetapi primernya spesifik dan jumlah pitanya lebih banyak. Marka AFLP dikategorikan 18-25 nukleotida. Contoh penggunaan AFLP pada tanaman teh yaitu; Dendrogam
menggunakan AFLP pada 32 klon teh, menghasilkan teh yaitu: Assam
(Assamica), China
(Sinensis),
dan Kamboja (Assamica ssp.
konsisten dengan klasifikasi atas dasar taksonomi dan asal daerah.
Lasiocalyx),
Jenis Marka Molekuler
1.3 SSR (Simple Sequence Repeats)
Kelebihan marka SSR :
Bersifat
akurat
membedakan evaluasi
diketahui
genotipe,
untuk diinginkan.
karakter
benih,
pemetaan, dan seleksi genotip
yang
lokasinya
pada
DNA
sehingga
dapat
mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi
untuk
kemurnian
tingkat
pembeda antar individu sangat tinggi serta dapat
mikrosatelit
merupakan alat bantu yang
sangat
sehingga
heterozigositasnya tinggi yang berarti memiliki daya
SSR yang juga sering disebut
dengan
kodominan
Mudah
dan
ekonomis
dalam
pengaplikasiannya
karena menggunakan proses PCR
SSR memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi stabil
secara somatik dan diwariskan secara Mendelian.
Jenis Marka Molekuler
Kelemahan teknik SSR adalah tidak tersedia pada semua spesies
tanaman, sehingga untuk merancang primer yang baru dibutuhkan waktu yang lama dan biaya yang cukup mahal (Powell et al., 1996 dalam Azrai, 2005).
Contoh penggunaan SSR pada tanaman
teh
yaitu
menggunakan
Freeman marka
et
al.
(2004)
SSR
untuk
menentukan keragaman pada tanaman teh.
Jenis Marka Molekuler
Non Non PCR PCR
RFLP RFLP (Restriction (Restriction Fragment Fragment Lenght Lenght Polymorphisme) Polymorphisme) Prinsip Prinsip kerja kerja dari dari RFLP RFLP adalah adalah Pemotongan Pemotongan DNA DNA pada pada sequence sequence yang yang
spesifik spesifik oleh oleh enzim enzim restriksi. restriksi. Hasil Hasil pemotongan pemotongan tersebut tersebut kemudian kemudian dianalisa dianalisa dengan dengan elektroforesis elektroforesis gel gel agarosa. agarosa. Enzim Enzim restriksi restriksi akan akan memotong memotong sequence sequence pada pada daerah daerah yang yang berbeda berbeda karena karena sequence sequence RFLP RFLP ini ini berbeda berbeda setiap setiap individunya. individunya. Tahapannya Tahapannya yakni yakni Isolasi Isolasi DNA, DNA, Pemotongan Pemotongan sequence, sequence, Menganalisa Menganalisa hasil hasil
pemotongan pemotongan dengan dengan elektroforesis elektroforesis gel gel agarose, agarose, Transfer Transfer DNA DNA dengan dengan Southern Southern blotting, blotting, dan dan terakhir terakhir Hibridisasi Hibridisasi DNA. DNA.
Jenis Marka Molekuler
Bersifat kodominan, sehingga sangat baik untuk komparatif pemetaan genom. Kelebihan
Polymorphisme akan menghasilkan perbedaan ukuran fragmen yang terpotong,
sehingga setiap siklus restriksi dapat dipetakan, dapat diturunkan dari nuclear genom, kloroplas genom, dan mitokondia genom (Adam et al., 1992). Menyita banyak tenaga dan waktu, kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan
Kekurangan
sangat tinggi, prosedur hibridisasinya rumit, sehingga menyulitkan otomatisasi,
dan memerlukan pustaka probe untuk spesies-spesies tanaman yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya (Prasanna 2002).
Contoh penggunaan RFLP pada tanaman teh yaitu Matsumoto et al.,
(2004) dengan RFLP menggunakan (PAL) untuk evaluasi 297 kultivar teh, didapat bahwa lokus PAL teh Korea paling sedikit 10 fragment alleles
Hal yang Harus Diperhatikan
dalam Pemilihan Marka Molekuler
Tentukan tujuan yang ingin dicapai, ini merupakan hal terpenting dalam pemilihan marka, karena akan berpengaruh pada pemilihan teknik yang akan digunakan.
Jumlah lokus atau alel yang ingin diketahui, AFLP mampu mendeteksi multilokus, ketika kita mengharapkan tingkat polimorfis tinggi teknik yang digunakan berbasis single locus yaitu SSR atau simple sequence repeats.
Perbedaan tingkat taksonomi, tingkat taksonomi perlu diperhatikan karena
akan berpengaruh pada variasi genetik. Oleh karena itu, pemilihan marka yang akan digunakan harus memperhatikan tingkat genus, spesies atau populasi.
Hal yang Harus Diperhatikan
dalam Pemilihan Marka Molekuler
Pola pewarisan, hal yang perlu diperhatikan adalah apakah pola pewarisan dari tanaman yang akan kita teliti bersifat homozigot atau heterozigot.
Kebutuhan DNA, beberapa marka molekuler memiliki perbedaan dalam
jumlah kebutuhan akan DNA untuk analisisnya. Teknik marka molekuler yang berbasis PCR membutuhkan DNA lebih sedikit daripada teknik non-PCR.
Keahlian, untuk melakukan teknik berbasis non-PCR (enzim restriksi) lebih
sulit dibandingkan dengan teknik marka molekuler berbasis PCR.
Biaya
Fasilitas Laboratorium (Alat dan Bahan)
Kecepatan/Waktu yang diinginkan.
SELEKSI BERBASIS MARKA MOLEKULER PADA
PADI GENERASI F2 GUNA MERAKIT GALUR PADI HARAPAN TAHAN WERENG COKLAT Pengembangan kultivar padi tahan wereng coklat dengan karakter agronomi yang diinginkan merupakan tujuan utama pemuliaan tanaman padi. Salah satu metode yang dapat digunakan dalam perakitan tanaman padi tahan wereng coklat yaitu dengan memanfaatkan teknik introgresi yang digabungkan dengan teknik Marker Assisted Selection (MAS).
Kultivar padi yang diketahui mempunyai tingkat ketahanan
tinggi terhadap berbagai biotipe wereng coklat adalah padi kultivar PTB-33. Kultivar PTB-33 diketahui mempunyai lebih dari satu gen ketahanan terhadap wereng coklat yaitu gen Bph2, gen Bph3 (Santhanalakhsmi et al., 2010), dan gen Bph4 (Jairin et al., 2007).
Pemilihan Tetua Penyisipan Gen Ketahanan
IP-1 (hasil persilangan IR-64 x
PTB-33) dan PP-11 (Pandan Wangi x PTB-33).
Seleksi dengan Teknik MAS
MAS pada Generasi F2 :
Seleksi generasi F2 dilakukan secara molekuler dengan menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction) metode SSR. Primer SSR yang digunakan yaitu RM586 dan RM8213.
Tahapan pengerjaan seleksi marka
molekuler secara berurutan yaitu :
Isolasi DNA Pengujian konsentrasi dan kualitas DNA Amplifikasi DNA dengan PCR Elektroforesis DNA visualisasi DNA Analisis data
UV-transluminator,seperangkat alat yakni tangki UV sebagai tempat penyinaran sampel DNA hasil elektoforesis gel agarosa dan komputer sebagai alat visualisasi hasil elektroforesis berupa gambaran panjang pita DNA.
UV-transluminator
PenggunaanUV-transluminatorakan menentukan berhasil tidaknya tahap elektroforesis DNA. Indikator keberhasilan tahap elektroforesis yaitu munculnya pita-pita DNA ketika divisualisasikan pada komputer minimal akan terlihat panjang pita DNA marker yang digunakan.
Daftar Pustaka
Azrai, M. 2005. Sinergi Teknologi Marka Molekuler Dalam Pemuliaan Tanaman Jagung. Jurnal Litbang Pertanian 25: 81-89.
Burt, B. 1994. Some concept and new methods for moleculer mapping in plants crop. In: Phillips, R.L. and I.K. Vasil (Eds.). DNA-Based Markers in Plants.
Bustaman, M dan S. Moeljopawiro. 1998. Pemanfaatan teknologi sidik jari dna di bidang pertanian. Zuriat. 9: 77-90.
Demeke, T and R.P. Adams. 1994. PCR Technology Current Innovation: The Use PCR RAPD Analysis in Plant Taxonomy and Evolution. CRC. Press. Inc.
Garcia, A.A.F., L. Luciana, Benchimol, A.M.M. Barbosa, I.O. Geraldi, C.L. Souza Jr. And A.P. de Souza. 2004. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR Markers for Diversity Studies in Tropical Maize Inbred Lines, Genetics and Molecular Biology 27: 579-588.
Ishak. 1998. Identifikasi DNA Genom Mutan Padi Atomita-2 dan Tetuanya Menggunakan RAPD Markers. Zuriat. 9: 71-83.
Prasetiyono, J. dan Tasliah. 2004. Marka Mikrosatelit: Marka Molekuler yang Menjanjikan. Buletin AgroBio: Jurnal Tinjauan Ilmiah Riset Biologi dan Bioteknologi Pertanian 6: 4551.
Tanaka and Taniguchi. 2002. Emphasized-RAPD (e-RAPD): Simple and efficient technique to make RAPD bands clearer. Breeding science 3: 225-229.
Yu and K.P. Pauls. 1994. PCR Technology Current Innovation: Optimation of DNA-Extraction and Procedures For RAPD Analysis in Plants. CRC. Press Inc.
Terima Kasih
Dokumen Serupa dengan Prosedur Seleksi Tanaman Menggunakan Marka Molekuler 3b
