REKAYASA GENETIK

Oleh :
Raymond P
131620150505

DEFINISI

Rekayasa genetik / manipulasi gen / kloning gen

/ teknologi rekombinan DNA / modifikasi gen
mekanisme pengaturan mengkode DNA &
membentuk susunan baru dari suatu gen
memanipulasi pencapaian tujuan yang
digunakan dalam bidang ilmu pengetahuan &
kesehatan

ASPEK

Penelitian mendasar pada struktur & fungsi gen

Membentuk generasi transgenik baru dari
tanaman & hewan
Kepentingan diagnosis & terapi suatu penyakit
Analisis gen dengan cara pengurutan DNA (DNA
sequencing)

KOMPONEN

TIPE SEL INANG

DALAM REKAYASA
GENETIK

SEL INANG
- Bergantung pada tujuan rekayasa genetik
- Tujuan : mengisolasi gen (analisis struktur gen) sel inang dgn
sifat sesederhana mungkin
- Tujuan : mengekspresikan informasi material genetik sel
inang & prosedurnya akan lebih rumit
- Syarat ideal :
- Mudah diolah & dimanipulasi
- Mudah didapat dalam jenis yang luas
coli
- Mudah cocok dengan vektor

Escherichia

PROKARIOT

TIPE
SELEUKARIOT
INANG

E. coli , Bacillus, Pseudomonas, &

Streptomyces.

Untuk tujuan yang sederhana (analisis

struktur gen)

(+) :
-

(+) :
Lebih banyak vektor yang mudah cocok
Memiliki membran nukleus
Bisa digunakan u/ proses yang lebih
rumit

Mudah diolah & dimanipulasi

Mudah didapat dalam jenis yang luas

(-) :
sedikit vektor yang cocok dengan sel
inang
Struktur sel lebih sederhana, tidak bisa
digunakan untuk proses yang lebih
rumit

Sel yang paling kecil seperti mikroba

(jamur & alga), sampai ke sel yang
multiselular seperti manusia
Untuk menciptakan perubahan genetik
yang baru dengan cara transgenik

(-) :
Proses yang ditempuh lebih rumit
tingkat kegagalan >>

PROKARIOT

TIPE
SELEUKARIOT
INANG

E. coli

Gram (-)
Kromosom tunggal (nucleoid)
Ukuran sekitar 4.6 x 106 kb
Sifat E. coli yang sederhana ini,
membuat E. coli merupakan sel
inang yang biasa dipakai di
laboratorium dalam proses
kloning gen.

Ragi Saccharomyces cerevisiae

Eukariot paling sering
Produksi roti & bir
Mampu cocok dengan vektor vektor
percobaan
Jumlah DNA 3.5 kali > E. coli

Aspergillus nidulans
Neurospora crassa
(Uniselular) Chlamydomonas
reinhardii
Tumbuhan & hewan :
dilakukan pada sel kultur lebih
mudah, dibandingkan dengan bila
melakukan rekayasa genetik pada
organisme utuh dari tumbuhan atau
hewan

VEKTOR DALAM
REKAYASA GENETIK

VEKTOR

Molekul DNA yang bisa direplikasi pada sel inang

yang cocok & bisa direplikasi ke dalam fragmen
DNA asing yang baru dikenali
Kebanyakan vektor yang digunakan : plasmid &
bakteriofag (suatu virus yang menginfeksi bakteri)

KARAKTERISTIK
VEKTOR
Mampu replikasi yang membuat vektor mampu bereplikasi sendiri di
sel inang
Memiliki lokasi yang bisa dipecah atau dilepas oleh enzim restriksi,
yang kemudian fragmen DNA asing yang baru bisa masuk mengisi
bagian tersebut
Mengandung penanda yang mudah untuk diidentifikasi oleh sel inang
Mudah dikenali oleh sel inang

JENIS

VEKTOR
PLASMID
Molekul untai ganda DNA, bundar, tidak bergantung pada kromosom
sel DNA, sekian ribu bps sampai lebih dari 100 kb
Materi ekstra kromosom DNA
Muncul dalam ikatan hubungan parasit atau simbiosis dengan sel
inangnya.
(-) : ukuran fragmen DNA kecil beberapa teknik diperlukan ukuran
fragmen DNA yang maksimal untuk dikloning mengganti vektor

VEKTOR
PLASMID

VEKTOR
PLASMID
KLASIFIKASI

VEKTOR
PLASMID
KLASIFIKASI

VEKTOR
BAKTERIOFAG

Virus yang menginfeksi bakteri

Sifat : berbahaya atau tidak (tergantung siklus sel hidupnya)
Fase hidup :
Siklus Lisis

Ketika bakteriofag masuk ke dalam sel bakteri, dia mampu memproduksi dirinya lebih
banyak lagi dan membunuh sel inangnya sifat berbahaya (bakteriofag lambda)
Siklus Lisogenik
masuk ke dalam kromosom dan berdiam diri tanpa membunuh sel inang sifat tidak
berbahaya
(+) :
Lebih besar, mencapai 20 kb
Setiap partikel bakteriofag mengandung rekombinan DNA yang mampu
menginfeksi setiap sel tunggal (infeksi ribuan x lebih efektif dari plasmid)

SIKLUS HIDUP BAKTERIOFAG

VEKTOR
BAKTERIOFAG

KLASIFIKASI

Pada proses perlekatan & pelepasan bakteriofag dengan sel

inang, dipengaruhi oleh gen 3

VEKTOR
BAKTERIOFAG

P
L
A
S
M
I
D

B
A
K
T
E
R
I
O
F
A
G

VEKTOR
KOSMID
Vektor lain dikembangkan untuk teknik rekayasa genetik yang
membutuhkan ukuran fragmen DNA yang lebih besar kosmid
Ukuran : 35 - 45 kb
Diproduksi dengan cara menginsersi gugus cos DNA bakteriofag
yang berukuran 5 kb ke dalam vektor plasmid Vektor kosmid
memiliki semua sifat utama plasmid

YAC

VEKTOR
YAC &
BACBAC

Yeast artificial chromosome

Gabungan komponen yang dibutuhkan

saat replikasi & pemisahan kromosom
ragi secara alami ke fragmen DNA
Ukuran panjangnya : hingga 1 Mb
Mengandung 2 urutan telomere (TEL),
1 sentromer (CEN), 1 autonomously
replicating sequence (ARS), & gen yang
beraksi sebagai penanda selektif pada
ragi
Penanda selektif untuk pertumbuhan
ragi pada media tertentu yang miskin
nutrisi
(-) : tidak stabil sehingga sering
kehilangan frgamen selama proses
rekayasa genetik berlangsung

Bacterial artificial chromosome

Dibuat untuk menghindari

permasalahan pada YAC

(+) :

Stabil
Mudah dikenali oleh sel inang
Mampu menghasilkan pertumbuhan E.
coli yang banyak sekaligus dalam
waktu singkat
Mudah dipurifikasi.2

METODE REKAYASA
GENETIK
ISOLASI DNA & RNA
PENANDAAN ASAM NUKLEAT
PENGURUTAN DNA
PEMOTONGAN DNA (ENZIM RESTRIKSI)

METODE REKAYASA
GENETIK
ISOLASI DNA & RNA

ISOLASI DNA / RNA

Step 1 : Melisis dinding sel

Menghancurkan sel inang (bakteri, virus, tumbuh tumbuhan
atau hewan) menggunakan enzim pendegradasi dinding sel
Proses ini harus dilakukan dengan sehati hati mungkin agar
tidak merusak struktur sel lainnya
Step 2 : deproteinase
Mengekstraksikan gol. fenol atau campuran fenol / kloroform
Molekul protein akan terpisah muncul di bagian permukaan
sel
Asam nukleat akan muncul di bagian paling atas cairan.

METODE REKAYASA
GENETIK
PENANDAAN ASAM
NUKLEAT

PENANDAAN ASAM
NUKLEAT
Problem : (dari kebanyakan rekayasa genetik) menjaga
kestabilan asam nukleat yang terlibat dalam proses ini
biasanya sangat sulit untuk tetap dipertahankan dalam jumlah
yang sama selama proses berlangsung kehilangan jumlah
asam nukleat di setiap tahapan
Solusi : penandaan asam nukleat kadar asam nukleat yang
sudah sedikit, akan tetap terlacak keberadaannya di setiap
proses

PENANDAAN ASAM
NUKLEAT

Radioaktif
Sering digunakan, penuh risiko, untuk identifikasi spesifik urutan
DNA/RNA
Isotop yang digunakan : titium ( 3H), carbon 14 (14C), sulfur 35
(35S), & fosfor 32 (32P)
Penanda akhir
Enzim polinukleotida kinase untuk memindahkan kelompok fosfat
terminal dari ATP ke titik terminal 5 hydroxyl dasam nukleat
Translasi Nick
Bergantung pada enzim DNA polymerase I untuk mentranslasi hasil
gugus fosfodiester pada DNA rantai ganda
Penandaan menggunakan pemanjangan primer
Menggunakan oligonukleotid acak untuk mensintesis rantai DNA
dengan bantuan DNA polymerase
DNA yang mau diberi tanda, dipanaskan terlebih dahulu
oligonukleotida primer dipatenkan ke dalam DNA rantai tunggal

METODE REKAYASA
GENETIK
PENGURUTAN DNA

PENGURUTAN DNA
Definisi : mengidentifikasi basa dengan menggunakan teknik tertentu yang bisa
mengidentifikasi secara detil setiap basa
Prinsipnya :
Persiapan fragmen DNA dalam bentuk yang cocok untuk proses pengurutan DNA
Teknik yang digukanan harus mencapai tujuan yang diinginkan
Metode pendeteksi harus mampu mengidentifikasi basa
Metode : (analisis menggunakan jel elektroforesis dan audiografi)
Allan Maxam dan Walter Gillbert : menggunakan bahan kimia u/ memecah DNA pada
posisi tertentu, & dibedakan o/ satu asam nukleotida
Fred Sanger dan Alan Coulson : melibatkan enzim sintesis untuk memisah rantai DNA
menjadi bentuk modifikasi nukleotida

METODE REKAYASA
GENETIK
PEMOTONGAN DNA (ENZIM

RESTRIKSI)

PEMOTONGAN DNA

Enzim restriksi PENTING dalam rekayasa genetik

Ditemukan di dalam sel bakteri fx : mekanisme pertahanan sistem modifikasi restriksi enzim restriksi
menghidrolasi setiap DNA eksogen yang muncul di dalam sel
Untuk mencegah aktivasi enzim di dalam DNA sel inang proses metilasi beberapa basa di dalam ururtan
yang terdeteksi oleh enzim restriksi
3 jenis : I, II, & III sering : tipe II (aktifitas lebih sederhana) memotong posisi internal dalam rantai DNA
endonuclease
Prinsipnya : mendeteksi urutak spesifik dari basa memotong rantai DNA
Contoh enzim yang diambil dari organisme
EcoR1 (GAATTC)
Sau3A (GATC)

POLYMERASE
CHAIN REACTION
(PCR)

PCR
Komponen penting :
Cetakan primer
Cetakan primer disintesis sebagai oligonukleotida dan dimasukkan ke dalam reaksi kemudian
selanjutnya siap untuk masuk ke dalam tahap denaturasi
DNA polimerase
DNA polimerase sebelumnya telah diinaktivasi dalam proses pemanasan denaturasi enzim
baru yang masih segar harus dimasukkan ke setiap siklus. Sifat DNA polimerase : stabil
terhadap proses pemanasan, mempermudah peneliti untuk menggunakannya
Asal : hasil prusifikasi bakteri Thermus aquaticus (Taq) (hidup di air panas)
4 buah dNTP untuk memastikan bahwa rantai DNA telah berhasil dikopi dan tidak terhenti
akibat adanya kekurangan monomer enzim

PCR
Step 1 :

DNA target & komponen reaksi digabungkan dipanaskan hingga 90o C untuk didenaturasi.

Step 2 :

Suhu turun cetakan primer akan semakin kuat untuk berlekatan dengan DNA rantai tunggal Taq polimerase
mulai mengkopi cetakan tersebut
Saat siklus selesai siklus akan kembali mengulang, begitu selanjutnya.

Keotomatisan pengulangan siklus PCR oleh sistem pemanasan yang disebut dengan thermal
cycler
Tujuan akhir proses ini : memanipulasi sampel
WARNING! Sekecil kecilnya kontaminan yang hadir di proses ini, sudah sangat cukup untuk
menggagalkan proses ini

APLIKASI
REKAYASA GENETIK
DIAGNOSISMEDIS
BIDANG
TERAPI

APLIKASI REKAYASA
GENETIK

APLIKASI
REKAYASA GENETIK
DIAGNOSIS
BIDANG
MEDIS

DIAGNOSIS KELAINAN
GENETIK
Muncul karena kelainan kromosom (penyimpangan)
atau akibat mutasi gen 1 kromosom saja tidak
normal kelainan kromosom secara meluas
Kondisi monosomik & trisomik bisa berefek pada
kromosom autosomal & kromosom seksnya kasus
Down syndrome (trisomi 21)

CONTOH KASUS PENYIMPANGAN

KROMOSOM

DIAGNOSIS KELAINAN
INFEKSI

Normalnya infeksi bakteri sangat sederhana untuk didiagnosis

Semakin spesifik karakteristik suatu infeksi dibutuhkan teknik

pemeriksaan lebih rumit (kultur mikroba) wajib dilakukan apabila suatu
infeksi tidak memberikan respon baik terhadap terapi suatu antibiotik

Metode tradisional banyak diaplikasikan dalam mendiagnosis penyakit

infeksi beberapa tidak bisa

Human Immunodeficiency Virus (HIV)

Standar tes : pendeteksi antibodi anti HIV ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay)
ELISA hasil positif palsu atau negatif palsu
Solusi : PCR untuk pengujian asam nukleat virus di limfosit T dari pasien.

Kasus lain yang menggunakan teknologi rDNA dalam mendiagnosis penyakit

infeksi : tuberkulosis, infeksi HPV, & Lyme disease

APLIKASI
REKAYASA GENETIK
TERAPI MEDIS
BIDANG

TERAPI GEN
Pendekatan terapi gen terhadap :
Sel somatik
Sel gamet
Gene replacement therapy :
Protokol pertama gen terapi kelainan gen yang
bersangkutan harus diidentifikasi terlebih dahulu
kemudian gen dikloning jenis yang cocok dimasukkan
ke dalam proses
Kedua harus ada sistem yang tersedia untuk
memasukkan gen ke dalam lokasi yang tepat pada tubuh
pasien
Terakhir gen bisa dimasukkan ke dalam gen yang sakit

TERAPI GEN

TERAPI GEN
ADA
Defisiensi adenosin deaminase

Sindroma imunodefisiensi yang berat

Gen yang berhubungan dengan ADA berlokasi di
kromosom 20.
Sebelum terapi gen ditemukan th/ : terapi pengganti
enzim tuj : memperbaiki enzim ADA menggunakan
polietilenglikol untuk menstabilisasi proses pengiriman
enzim
Step 1 limfosit dipindahkan dari pasien & dipajankan
ke vektor rekombinan retroviral untuk memindahkan
fungsi gen ADA ke dalam sel Limfosit dimasukkan ke
dalam tubuh pasien sumsum tulang digunakan untuk
modifikasi

TERAPI GEN
KISTA FIBROSA
Pengobatan farmakologi bisa pemberian enzim
digestif & pemberian antibiotik mengurangi gejala
dengan untuk menangani infeksi
Terapi gen pada kasus kista fibrosa Vektor
adenovirus juga digunakan pada kasus ini

TERIMA KASIH