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BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADA AL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA

Dra Daniela Centrn


Depto de Microbiologa, Parasitologa e Inmunologa
de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Buenos Aires
CONICET

Que es la biologa molecular?


Estudio de la biologa a nivel molecular
Se superpone con reas de
la biologa y la qumica, en
particular gentica y
bioqumica

Estudio de los procesos celulares

De la gentica clsica a la biologa molecular


al diagnstico especializado

CONTENIDOS
I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS
A. Biosntesis de cidos nucleicos: replicacin, transcripcin.
B. Biosntesis de protenas: traduccin.
C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones.

II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE


A. Enzimas utilizadas en biologa molecular.
B. Vectores de clonado y de expresin.
C. Construccin de bibliotecas genmicas.

III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA


A. Mutaciones y mutantes.
B. Elementos extracromosmicos. Plsmidos.
C. Adquisicin de material gentico exgeno.

IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION


DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS
A. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
B. Hibridizacin de cidos nucleicos.
C. Epidemiologa molecular bacteriana.
D. ADN ramificado (branched DNA).
E. Secuenciacin de cidos nucleicos.
V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES
ETIOLOGICOS MICROBIANOS
A. Bacterias
B. Virus
C. Hongos
D. Mecanismos de resistencia a antibiticos

VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION

CRONOLOGA

Gentica AM

y DM

Mendel 1866

GENTICA AM

Las partculas de la herencia se


mezclaban

Un parental aporta ms que el otro


Herencia de caracteres adquiridos

MENDEL Y LOS FACTORES


DE LA HERENCIA

GENTICA DM

LA GENTICA Y
LOS GENES......

ADN o PROTENAS?
.en busca del material hereditario.
Que caractersticas debera presentar
el material hereditario?

Perpetuarse (replicarse)
Manifestarse (expresarse)
Cambiar (mutar)
Combinarse (recombinarse)

1902-Theodore Boveri- William Sutton

1865

Establecen la hiptesis segn la cual los cromosomas,


segregados de modo mendeliano,
son unidades hereditarias.

1865

1915 - T.H. Morgan


Los genes se
disponan
linealmente en el
cromosoma

Se comienza a hablar de gentica.....

1928 - Frederick Griffith

1865

Colonias Rugosas

Colonias Lisas

Transformacin de
Streptococcus pneumoniae
Clulas L
vivas

Bacteria

Inyeccin

Resultados

Clulas L
Clulas R muertas por
vivas
calor

cpsula

Clulas L muertas por


calor junto a celular R
vivas

factor de
transformacin

1865

1944 - Avery, MacLeod & McCarty

El ADN purificado es el factor de transformacin


El ADN de las clulas lisas
transformaba a las rugosas

Oswald Avery

Colin MacLeod

Maclyn McCarty

Su teora fue rechazada por dos razones:


De ser as cada especie debera tener un tipo diferente de ADN
La composicin qumica del ADN era demasiado simple para
contener toda la informacin para la vida

1865

1952 - Hershey & Chase

El ADN viral (no las protenas) programa


las clulas

Martha Chase & Alfred Hershey

Bacterifagos

los genes se componen de ADN, base


qumica de la herencia

LA ESTRUCTURA DEL ADN...

1947 - Erwin Chargoff

1865

Las bases de ADN siguen


ciertas reglas
La composicin es especie
especfica
A = T, C = G en todas las especies

AT

GC

1865

1953 - Franklin & Wilkins

La naturaleza helicoidal del ADN

Rosalind Franklin

Film
fotogrfico

Fuente de rayos X
DNA cristalizado

Maurice Wilkins

1865

1953 - Watson & Crick

Descripcin de la estructura tridimensional


del ADN

Francis Crick & James Watson

1865

1953 - Watson & Crick

Que dedujeron de:


Datos de R. Franklin
hlice doble
ancho uniforme de 2 nm
bases separadas por 0.34 nm
Chargoff
la adenina se aparea con la
timina
la citocina se aparea con la
guanina

1865

1953 - Watson & Crick

Que dedujeron ellos


mismos?
Las bases estn hacia adentro,
y los fosfatos y las azcares
hacia afuera
Enlaces de hidrgeno
Hebras antiparalelas
Sugirieron un modo semiconservativo de replicacin

ESTRUCTURA DEL ADN


... 2 de abril de 1953,
Molecular Structure
of Nucleic Acids.
A Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid.
Nature 171: 737.
No ms de 900 palabras..

J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

QUE ES EL ADN???
POLMERO LARGO,
NO RAMIFICADO,
COMPUESTO POR
CUATRO TIPOS
DE SUBUNIDADES

Bases nitrogenadas
Se combinan con
azcares y fosfatos

DESOXIRIBONUCLETIDOS
Nucletido=base+azcar+fosfato
Nuclesido=base+azcar

MONMERO

Del nucletido al ADN

ENLACE FOSFODIESTER ENTRE


EL CARBONO 5 DE UNA
DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO
FOSFATO DEL SIGUIENTE
NUCLETIDO FORMANDO UN
NUCLETIDO MONOFOSFATO.
EL POLMERO SE FORMA AL
ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3
DEL OTRO NUCLETIDO

DIRECCIN
(5a 3)
5

Estructura estabilizada por


puentes hidrgeno

Doble hebra

Antiparalela

3
ESTRUCTURA PRIMARIA

Apareamiento:
A-T
G-C
Polmero uniforme
10 bases por
vuelta

Surco menor

Surco mayor

ESTRUCTURA SECUNDARIA

REGION
REGULATORIA

Codn de iniciacin

Codn de terminacin

1865

ADN en Procariotas
ESTRUCTURA
TERCIARIA

Cromosoma bacteriano
ADN doble cadena (1mm long)
circular
cerrado
Condensado y ordenado (supercoiled o superenrollado)

1865

Plsmidos en Procariotas

Tamao de 1 a 400Kb
Cantidad variable de copias en una clula
Origen de replicacin propio
Pueden movilizarse a otros genomas
Puede integrarse al cromosoma bacteriano

1865

ADN en Eucariotas

1 o ms cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)


Localizado en ncleo
Empaquetado por histonas y otras protenas cromatina

Molculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

1865

Replicacin del ADN

Semiconservativa:
dos hebras generan una copia cada
una

1865

Iniciacin

comienza siempre en una secuencia especfica de nucletidos


conocida como origen de replicacin,
en el que hay un gran contenido de adenina y timina.

Iniciacin

1865

iniciador
Sntesis de primers de
ARN
Iniciacin de la
replicacin

Unin de
iniciador

Horquillas se mueven en
direccin opuesta

Formacin de
dos hebras de
replicacin

ADN circulares
(Procariotas)
Origen de replicacin (oriC)

ADN lineales
(Eucariotas)
Varios replicones

Elongacin

1865

ADN polimerasa
III

ADN primasa
ARN primer
ADN ligasa

Hebra
retrasada
Frag. de Okazaki

Hebra lder
Topoisomerasa

ADN polimerasa III


Helicasa
Protenas de unin al ADNss

La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada


una de las cadenas primitivas, en sentido 5 3 partiendo de un ARN corto
especfico llamado ARN cebador molcula formada por nucletidos de ARN
catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa
comienza a aadir nucletidos.

Proof-reading
DNA polimerasa comete un error cada 108 1010 bases

Incorporacin de G X A

Pol III escinde G con actividad


exonucleasa 3 a 5

Incorporacin de A

1865

Terminacin

Fragmentos de Okazaki
Ligasa

Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento
de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,
conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recin sintetizado, catalizando
las reacciones de condensacin que unen los grupos fosfato y azcar de los
nucletidos contiguos y as, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki
se completa la doble hlice de ADN.

1865

1957 - Francis Crick


Propuso el dogma central
ADN

ARN
PROTEINAS
Transferencia de informacin
biolgica

1865

El ADN y el ARN

cidos nucleicos
Macromolculas
Polmeros (monmero de nucletidos)
Uniones fosfodister
Molculas ms grandes que se conocen.

Diferencias entre la qumica del ADN y el ARN

1865

El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa


en lugar de la desoxirribosa.
El ARN tiene como base el uracilo en lugar
de la timina.
Una clula tpica contiene 10 veces ms ARN que ADN.
El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

1865

Estructura del ARN

1865

Tipos de ARN segn sus funciones

Componente principal del ribosoma

Decodifica el ARNm para sintetizar las protenas


Interacciona con ARNt durante la traduccin
En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S
En Eucariotas, 40S y 60

ARNr
(ribosomal)

1865

Tipos de ARN segn sus funciones

ARNt
(de transferencia)
aa
Encargados de transportar los aminocidos a los ribosomas
para incorporarlos a las protenas, durante el proceso de
sntesis proteica.
Decodificacin mediante apareamiento con el codn del
ARNm

anticodn

1865

Tipos de ARN segn sus funciones

ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para sntesis proteica
(ARNr y ARNt)
ARN corto de interferencia (siARN: del ingls: small interfering RNA ): son
componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN
involucrados en la regulacin.
Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actan como llaves "encendidoapagado" de gran precisin.
ARN catalticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la
molcula propiedades catalticas como corte de ARN o ADN y ligacin.

El ARN posiblemente
fue el primer biopolmero
que apareci en la corteza terrestre
durante el transcurso de la evolucin.

Como se leen los ARNm??

1961- Nirenberg y Ochoa


1865

Sistema libre de clulas

UUUUUUUU
AAAAAAAA
CCCCCCCC
GGGGGGG

fenilalanina
lisina
prolina
glicina

El cdigo gentico

43=64

ARNm

Demostraron que hay 61 tripletes -o codonesque codifican aminocidos,


muchos de los cuales son codificados por ms de un codn,
por lo que se dice que el cdigo est degenerado.
y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados
como seales de terminacin.

1865

TRANSCRIPCIN

ADN

ARN
PROTEINAS

Requerimientos:
Cadena de ADN
como matriz
ARN polimerasa
Ribonuclesidos
trifosfatos
Regin promotora

TRANSCRIPCION
ARN polimerasa

Principio de un gen

ADN

Iniciacin
La ARN polimerasa junto a factores de transcripcin se une a sitio donde
va a iniciar la transcripcin

Promotor

En bacterias
Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son
reconocidas por factor sigma.
ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5 a 3
Un promotor expresa varios genes (OPERN)

Promotor en Eucariotas

Regin promotora
Involucra varios
factores de
transcripcin
(protenas)
Cada gen tiene su
promotor

TRANSCRIPCION
Hebra antisentido
Direccin de la transcripcin

3del gen

5del gen
5del ARNm

3 del ARNm
Hebra sentido:
contiene la informacin
gentica
Hebra antisentido:
provee el molde para
la sntesis del ARNm

ARNm

Elongacin
Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN
y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodister.

TRANSCRIPCIN
La ARN polimerasa
deja el ADN
ARN mensajero liberado

El ADN se aparea nuevamente

Terminacin
Desestabilizacin del
complejo
ARN-ADN

Rho-independiente (Secuencias palindrmicas del ADN que en


estadio de ARN adopta una estructura en horquilla)
Rho-dependiente (mediada por la protena)

1865

TRANSDUCCIN

ADN

El nombre protena proviene


de la palabra griega proteios,
que significa lo primero.

ARN
PROTENAS
Las protenas son macromolculas
formadas por aminocidos

TRADUCCION
ARNt

Sitio de unin
al aminocido

Uniones hidrgeno entre


pares de bases

Iniciacin
La iniciacin procaritica es el resultado de la asociacin de las subunidades pequea
y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt)
con el codn de iniciacin mediante el emparejamiento de bases anticodn-codn.

TRADUCCION

Elongacin
La elongacin de la cadena polipeptdica
consiste en la adicin de aminocidos al extremo carboxilo de la cadena.

TRADUCCION
Continua la elongacin

Polipptido
Creciente

Este proceso continua hasta


que llega a un codn stop

TRADUCCION

Nueva protena sintetizada

Carboxilo terminal

Amino terminal

Terminacin
La terminacin ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminacin
del ARNm, que no son reconocidos por ningn ARNt.

QU ES UN GEN ?
Un segmento de ADN que contribuye a un
fenotipo/funcin. En ausencia de una funcin
demostrable, un gen puede ser caracterizado por
secuencia, transcripcin u homologa.
Human Gene Nomenclature Committee

En Procariotas.....

Opern
Transcripcin policistrnica (ARNm de varios genes)

En Eucariontes...
REGION
REGULATORIA

+1

EXONES

FIN
TRANSCRIPCION
INTRONES

Un promotor para cada gen

LA DECADA DE LOS
70

1865

1970 - Smith & Nathans

Descubrimiento de las enzimas de restriccin


Hamilton Smith
Descubri HindII en
Haemophilus influenzae

Daniel Nathans
Utiliz HindII para hacer el
primer mapa de restriccin del
SV40

1972 - Paul Berg

1865

El primer ADN recombinante utilizando EcoRI


Sitios de reconocimientoEcoRI
DNA
plasmidico

EcoRI corta el DNA en


fragmentos

Extremos
pegajosos

DNA
recombinante

SV40 DNA

DNA ligasa

1865

1973 - Boyer, Cohen & Chang

Transformacin de E. coli con plsmidos


Gen resistente a la canamicina
recombinantes
Plasmid
pSC101

Gen resistente a
la tetraciclina

Stanley Cohen &


Annie Chan

Medio con canamicina y tetraciclina

E. coli
transformada con
plsmidos
recombinantes

Slo crecen colonias recombiantes

Herbert Boyer

1865

1977 - Genentech, Inc.

La primera protena humana producida por una


bacteria transgnica (somatostatina)
Compaa fundada por
Herbert Boyer y Robert
Swanson en 1976
Considerada el
advenimiento de la edad de
la biotecnologa

LA DECADA DE LOS
80

1865

1980
La suprema corte de U.S. permite patentar formas de
vida
1985
Se prueban plantas modificadas genticamente

En 1988 el National Center for Biotechnology


Information (NCBI) y el GenBank

Margaret Dayhoff

LA DECADA DE LOS
90

1865

LOS 90: GENOMAS Y CLONES

1995
primer genoma: Haemophilus influenzae.

1996
Genoma de Saccharomyces cerevisiae

1997
Se clona Dolly

1998
Genoma de C. elegans

COMO FUNCIONA UN GENOMA?


GENMICA Y PROTEMICA

26 de junio del 2000: se concluy


el proyecto del GENOMA HUMANO,
en el cual se invirti ms de 3.000 millones de dlares..

EL
FUTURO......

Genmica y sociedad
Genmica y salud
Genmica biolgica

MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!

dcentron@gmail.com