Kultur
Spesimen purulen
Membuat hapusan tipis dengan wire loop steril. Tidak
boleh disentrifus.
Co: CSF yg mengandung sel pus
Spesimen cair non-purulen
Sentrifuse cairan & buat suatu hapusan dari tetesan
sedimen yg telah tercampur merata.
Kultur
Emulsikan koloni dengan air suling yg steril, kemudian
buat hapusan tipis pada slide.
Bila menggunakan suatu broth culture, pindahkan
loopful kedalam slide dan buat hapusan tipis.
Cara membuat hapusan
Sputum
Gunakan sebatang stik yg bersih untuk memindahkan
dan meratakan bahan purulen dan caseous pada slide.
Rendam stik dalam desinfektan fenol atau hipoklorit
sebelum dibuang.
Swabs
Gelindingkan hasil swab pada slide (agar tidak merusak
sel-sel pus).
Terutama penting untuk mencari bakteri intraseluler
seperti N. gonorrhoeae (swab uretra, serviks, atau mata).
Faeces
Gunakan sebatang stik yg bersih untuk memindahkan pus
dan mukus ke slide.
Ratakan untuk membuat hapusan yg tipis.
Lakukan dekontaminasi stik sebelum membuangnya.
Cara membuat hapusan
Keringkan dan fiksasi hapusan
Letakkan slide di tempat yg aman mengering di
udara. (terlindung dr debu, lalat, kecoak, semut, dan
sinar matahari langsung)
Bila memerlukan pewarnaan cepat, dapat
dikeringkan menggunakan pemanas yg lembut.
(gentle heat)
Fiksasi bertujuan untuk mengawetkan
mikroorganisme & mencegah hapusan terbilas saat
pewarnaan.
Hapusan dapat difiksasi menggunakan pemanasan,
alkohol, atau bahan kimia lain.
Cara membuat hapusan
Fiksasi dengan pemanasan
Sering dilakukan.
Pemanasan yg berlebihan merusak organisme,
menyebabkan perubahan pada reaksi pewarnaan, &
merusak leukosit, sehingga kurang cocok untuk
memfiksasi hapusan organisme intraseluler (N.
gonorrhoeae & N. meningitidis).
Tehnik yg dianjurkan :
1.Membiarkan hapusan mengering sempurna diudara.
2.Lewatkanslide diatas api Bunsen dengan cepat
sebanyak 3x
3.Biarkan hapusan menjadi dingin dulu
sebelum diwarna.
Fiksasi dengan alkohol
Kurang merusak organisme dibandingkan dengan fiksasi
dengan pemanasan.
Sel-sel (terutama sel pus) terfiksasi dengan baik.
Dianjurkan untuk memfiksasi hapusan dengan organisme
diplokokus intraseluler gram negatif.
Namun fiksasi dengan alkohol lebih bakterisidal
dibandingkan fiksasi pemanasan. (co: M.tb pada spesimen
sputum lebih cepat terbunuh setelah terkena alkohol 70%.
Tehnik:
1.Biarkan hapusan mengering sempurna di udara.
2.Untuk mendeteksi organisme diplokokus gram (-)
intraseluler teteskan 1-2 tetes metanol absolut /
etanol absolut. Untuk organisme lain seperti M.tb
difiksasi dengan 1-2 tetes metanol 70% v/v atau etanol
70% v/v.
3.Biarkan alkohol pada hapusan selama 2 menit / hingga
alkohol menguap.
Pewarnaan Gram
Tujuan : mengidentifikasi patogen pada spesimen & kultur dengan
menggunakan reaksi Gram (+/-) & mengetahui bentuk
mikroorganisme.
Sel pus juga dapat diidentifikasi menggunakan pewarnaaan Gram.
Reaksi Gram disebabkan karena perbedaan permeabilitas
dinding sel bakteri Gram (+) dan Gram (-) selama proses
pewarnaan.
Reagen
Pewarna kristal violet : pewarna primer
(gentian violet atau metil
violet)
Lugols Iodine : menstabilkan kristal violet pada lapisan
peptidoglikan
Acetone-alkohol : dekolorisasi, melarutkan lipid (gram
decolorizer negatif)
Prosedur Pewarnaan
Gram
100x
MEDIA ORGANISME
Thayer Martin Agar Neisseria sp.
Lowenstein Jensen Mycobacterium
SS Agar tuberculosis
Saboround Dextrose Salmonella sp., Shigella
Agar sp.
Loeffler Agar Yeast
TCBS Agar C. diptheriae
V. cholerae
3.Media selektif
Cara lain untuk menyeleksi organisme :
1. Kondisi inkubasi
P. aeruginosa dihambat oleh kondisi
anaerobik.
2. pH media
V. cholerae dapat diisolasi pada media basa
seperti agar TCBS.
3. Suhu
Listeria monocytogenes dapat tumbuh pada
suhu 4o C sedangkan organisme lain
pertumbuhannya terhambat.
4. Media Indikator /
diferensial
Adalah
media yg ditambahkan pewarna /
bahan lainnya untuk membedakan
mikroorganisme.
Cair
Kebanyakan digunakan sebagai ennrichment
(membiakkan organisme yg kemungkinan berjumlah
sedikit) contoh: kultur darah.
Untuk tes biokimia:
menggunakan peptone water sugars / media yg
mengandung tryptophan untuk mendeteksi adanya
produksi indole oleh beberapa enterobacteria.
Persiapan Media
Kultur
Menyiapkan media yg terbuat Masukkan bubuk agar ke dalam
dari bahan-bahan yg dikeringkan air dan aduk untuk
(powder or granulated culture melarutkannya. (tidak boleh
media) pada tempat yg kering. dikocok).
Cuci tangan segera setelah Pemanasan medium yg
menyiapkan media. berlebihan mengubah nutrisi,
Segera buat medium setelah komposisi gel, dan pH. (tidak
menimbang bahan. boleh mendidih)
Autoklaf
Paling banyak digunakan untuk mensterilkan
media kultur.
Untuk merusak endospora bakteri & sel vegetatif.
Harus dilakukan dengan suhu yg benar & durasi
waktu yg tepat :
- Underautoclaving medium yg tidak steril.
- Over-autoclaving presipitasi, perubahan pH
& merusak komponen esensial dalam medium.
Steam pada suhu 100C
Untuk mensterilkan media dari bahan-bahan yg akan
rusak / menjadi tidak aktif pada suhu > 100C.
Contoh : Cary-Blair transport medium.
Untuk mencairkan kembali media agar steril di dalam
botol.
Steaming berulang bergantung pada jenis medium.
Steaming dapat dilakukan dalam autoklaf dengan
tutup yg dilonggarkan atau bentuk sterilisasi uap
seperti steamer Arnold / steamer Koch.
Tutup botol media dilonggarkan, kemudian diletakkan
padas nampan yg berlubang, lalu diletakkan diatas
air mendidih setelah sterilisasi dan medium
menjadi dingin kembali tutup botol ditutup rapat.
Filtrasi
Untuk menyingkirkan bakteri dari suatu cairan,
misalnya: serum dan larutan yg mengandung urea
& karbohidrat tertentu.
Terutama untuk mensterilkan bahan-bahan yg
sensitif terhadap panas (tidak boleh dengan
autoklaf).
Beberapa jenis filter terbuat dari sintered glass /
inert cellulose esters.
Filter selulosa / filter membran lebih disukai karena
dapat menyaring lebih cepat, tidak mempengaruhi
filtrat, menyerap sangat sedikit bahan yg difiltrasi.
Ukuran pori bervariasi, dan untuk filtrasi
pensterilan menggunakan ukuran pori : 0,22 m.
Tes Media Kultur
Tes sterilitas (mengetes adanya
kontaminan media)
Tes performa
Kontrol agar nutrient, agar darah, agar coklat.
Kontrol media differential, selektif, transpor &
biokimia.
Kontrol species
Pemberian label & penyimpanan media
kultur & additives (darah, serum,
antimikroba, urea, & karbohidrat).
Sterilisasi peralatan dengan hot air oven.
160 C selama 45-60 menit (kaca, logam)
Inokulasi Media Kultur
Tehnik yg aseptik
Lakukan pembakaran di api
untuk mensterilkan wire loop,
straight wire, dan forsep logam
sebelum dan setelah
digunakan.
Bakar leher botol spesimen,
botol / tabung kultur setelah
memindahkan isinya dan
sebelum menutupnya kembali.
Hindari tutup botol menyentuh
bagian yg tidak steril.
Inokulasi Media Kultur
Tehnik yg disederhanakan
(cocok digunakan dalam klinik) Inokulasi pada sepertiga area plate
Inokulasi pada media
miring
Media miring : Dorset egg medium / Loeffler
serum.
Menggunakan straight wire yg steril.