Anda di halaman 1dari 27

TRANSFORMASI

GENETEIKA TANAMAN

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Tahapan rekayasa genetik tanaman meliputi:
1. isolasi gen yg akan direkayasa
2. penyambungan mol.DNA ke dlm vektor (vektor
sementara / tetap) & perbanyakannya
3. transformasi sel / jaringan / organ tan.dg DNA
rekombinan yg bawa gen asing
4. analisis dan konfirmasi ekspresi gen asing pd
tanaman
5. perbanyakan dan diferensiai sel / jaringan tan.yg
bawa gen asing tan.seutuhnya
6. aklimatisasi tan.transgenik sebelim dilepas ke
lahan pertanian

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Isolasi gen tanaman yg akan direkayasa dpt
dilakukan dengan:

1. teknik isolasi secara acak: isolasi DNA total


tanaman dg cara lisis sel / jaringantan. potong dg
enzim restriksi bbrp macam ukuran fragmen DNA
pilih yg akan diklon berdasarkan atas ukuran yg
dikehendaki
2. teknik PCR; primer yg digunakan utk amplifikasi
dpt ditentukan berdasarkan informasi yg sdh ada
(mis.mengacu pd urutan DNA gen sejenis yg ada pd
jasad atau gunakan primer universal

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Isolasi gen tanaman yg akan direkayasa dpt
dilakukan dengan:

3. teknik sintesis cDNA; isolasi mRNA suatu jar.tan,yg


diket. / diasumsikan ekspresikan gen yg akan diisolasi
gunakan sbg cetakan utk sintesis urutan nukleotida
DNA yang komplementer dg enzim transkriptase balik
seleksi cDNA yg diperoleh dg pelacak DNA yg sesuai
utk urutan DNA gen yg diklon tsb. Fragmen DNA yg
diperoleh sisipkan pd vektor kloning; hrs dpt utk
perbanyakan mol. DNAyg disisipkan seblm akhirnya
digunakan utk transformasi sel / jar. tanaman. Vektor yg
umum digunakan berbasiskan plasmid Ti yg berasal dari
Agrobacterium tumefaciens.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Isolasi gen tanaman yg akan direkayasa dpt dilakukan
dengan:
1. teknik isolasi secara acak: isolasi DNA total tanaman dg
cara lisis sel / jaringantan.
potong dg enzim restriksi bbrp macam ukuran
fragmen DNA pilih yg akan diklon berdasarkan atas ukuran yg
dikehendaki
2. teknik PCR; primer yg digunakan utk amplifikasi dpt
ditentukan berdasarkan informasi yg sdh ada (mis.mengacu pd
urutan DNA gen sejenis yg ada pd jasad atau an.lain , atau
gunakan primer universal
3. teknik sintesis cDNA; isolasi mRNA suatu jar.tan,yg diket. /
diasumsikan ekspresikan gen yg akan diisolasi gunakan sbg
cetakan utk sintesis urutan nukleotida DNA yg komplementer dg
enzim transkriptase balik seleksi cDNA yg diperoleh dg
pelacak DNA yg sesuai utk urutan DNA gen yg diklon tsb.
Fragmen DNA yg diperoleh sisipkan pd vektor kloning; hrs
dpt utk perbanyakan mol. DNAyg disisipkan seblm akhirnya
digunakan utk transformasi sel / jar. tanaman. Vektor yg umum
Bioteknologi Farmasi,
digunakan berbasiskan F. MIPA
plasmid Ti yg Universitas
berasal dari Pakuan -
Beberapa Penanda Resistensi terhadap Antibiotik atau Herbisida

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Teknik transfer gen asing ke dlm tanaman
Transfer gen suatu jasad ke tana. dpt dilakukan dg
(A) transformasi protoplas, (B) transformasi sel /
jar.tanaman sifat totipotensi sel tanaman.
(A) Transformasi protoplas
Protoplas memp.kelebihan utk digunakan sbg
bahan awal transfer gen asing ke dlm tanaman Krn
transfer gen (plasmid rekombinan) terjadi hanya
melalui membran sel (ddg sel sdh dihilangkan), dan
semua sel tan.transgenik yg diregenerasi dr prtoplas
akan mengandung gen asing tg diinginkan
tan.memp.komposisi genetik yg seragam.Transformasi
protoplas dg gen asing dpt dilakukan dg bbrp cara:
a. gunakan senyawakimia tertentu, mis.PEG
b. teknik elektroporasi
c. gunakan perantara bakteri A. tumefaciens
d. transfer gen dg sonifikasi
Bioteknologi
e. transferFarmasi, F. MIPA Universitas
gen dg perantaraan liposome. Pakuan -
Liposome dpt digunakan utk transfer gen asing ke dlm protoplas
tanaman; liposome yg bawa plasmid difusikan dg protoplas
menggunakan PEG; kelebihan teknik ini: (1) DNA terlindungi dari
kemungkinan adnya aktivitas nuklease, (2) toksisitas liposome
rendah, (3) DNA yg ada dlm liposome lebih stabil dlm
penyimpanan, dan (4) dpt diaplikasikan pd banyak tanaman.

(B). Transformasi sel atau jaringan tanaman yg utuh.


Transfer dpt digunakan dg metoda:
(1) transformasi gunakan perantara A. tumefaciens,
(2) biolistik, dan (3) mikroinjeksi / makroinjeksi.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


(1) Transformasi tan.dg perantaraan A. tumefaciens.
Plasmid rekombinan dibuat dg menyisipkan gen asing ke dlm T-
DNA yg ada pd plasmid Ti pindahkan plasmid rekombinan ke
dlm bakteri A. tumefaciens. Hal ini dpt dilakukan dg menggunakan
teknik konyugasi antara bakteri E. coli yg membawa plasmid
rekombinan, dg bakteri A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti sbg
plasmid pembantu (helper plasmid).
Sel A. tumefaciens yg sdh membawa gen rekombinan
selanjutnya ditumbuhkan bersama jar.tan.yg akan ditransformasi
(disebut teknik ko-kultivasi). Jar.tan.yg akan dikokultivasi dg A.
tumefaciens dpt diambil dari irisan daun (leaf disc) celupkan
sebentar dlm kultur A. tumefaciens berumur semalam letakkan pd
kertas filter steril letakkan pd medium selektif utk proses ko-
kultivasi dg bakteri A. tumefaciens 2-3 hari.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Medium itu juga mengandung antibiotik yg sesuai, herbisida atau
bahan kimia lain yg bersifat selektif hanya jar. tan,.yg telah alami
transformasi saja yg tetap dpt tumbuh.
Jaringan tanaman yg tumbuh tsb. diteruskan sampai berkembang
membtk bakal tanaman (plantlet) pindahkan ke pot berisi tanah
utk pertumbuhan lanjut. Utk analisis keberhasilan: uji dg teknik
DNA blotting, PCR, atau analisis ekspresi gen asing yg disispkan.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Skema Transfer Gen
Asing (DNA
Rekombinan) ke dalam
Sel Tanaman untuk
Menghasilkan Tanaman
Transgenic. Selain ketiga
metode tersebut masih
ada metode lain yaitu
mikroinjeksi dan
makroinjeksi.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Skema Transformasi Tanaman
Menggunakan Teknik Ko-
kultivasi dengan Bakteri
Agrobacterium tumefaciens
yang Membawa Plasmid
Rekombinan. Dalam skema di
samping digunakan contoh
penggunaan sistem plasmid
biner untuk kloning gen asing
ke dalam tanaman.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


(2) Transfer gen ke dlm tanaman dg teknik biolistik

Dlm teknik biological ballistic, sel / jar.tan.ditembakidg alt


tembak mikroprojektil yg membawa DNA rekombinan
(dikembangkan th.1987 oleh Prof.Stanford cs. Un. Cornell).
Teknik ini sesuai utk diterapkan pd tan.yg sulit alami regenerasi
dg teknik kultur in vitro atau yg tdk kompatibel dg teknik ko-
kultivasi dg A. tumefaciens spt padi dan jagung. Alat
spt di halaman berikut. Microcarrier mengandung partikel
tungsten yg dilapisi DNA yg akan ditembakkan. Sel / jar.diletakkan
di bawah stopping plate ; penembakan dg alirkan gas helium pd
kecepatan tinggi dorong microcarrier mengandung DNA lewati
stopping plate tembus sel / jar. regenerasi pd medium yg
sesuai tan.transgenik utuh.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


(3) Metoda mikroinjeksi dan makroinjeksi jaringan tanaman
Mikroinjeksi: injeksikan DNA asing ke dlm sel-sel embrio,
gunakan alat mikromanipulator & alat khusus lain; injeksi ke
nukleus / sitoplasma. Seblmnya DNA di-amobilkan mis. Dg
agarose, agar, atau Na-alginat. Yg berpengalaman,dpt injeksi 100-
200 sel /jam.
Makroinjeksi dilakukan dg menginjeksikan DNA total dari 1
varietas, misalnya kapas, ke dlm varietas kapas lainnya.

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Aplikasi rekayasa genetik pada tanaman
Pengembangan teknologi DNA rekombinan utk tan.transgenik
implikasi sangat besar pd bidang pertanian pemuliaan tanaman
sesuai yg diinginkan. Aspek yg dikembangkan meliputi
- perbaikan sifat fisiologis tan. Mis. Pengubahan kandungan
as.lemak, tingkatkan kandungan
provit.A., ubah warna bunga, penundaan pemasakan
- pengembangan resistensi tan.thd hama dan penyakit tanaman
- pengembangan resistensi tan.thd herbisida
- hasilkan protein terapeutik, antibodi monoklonal maupun vaksin
rekombinan yg diekspresikan di dlm bag. tan. tertentu misalnya
buah

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Skema Alat Biolistik
untuk Melakukan
Transformasi Sel
Tanaman

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Beberapa macam tanaman transgenik yg sudah dikembangkan
Spesies tanaman Gen yg disisipkkan Asal gen Karakterbaru yg diperoleh

Oryza sativa Gen pengkode:


(Golden rice) Phyton synthase Daffodil Produksi provitamin A
Lysopene cyclase Daffodil (-karoten) pd endo-
Phytoene desaturase Erwinia carotovora sperm
Oryza sativa Gen phosphinothricin Streptomyces Toleransi thd herbisida
N-acetyltransferase hygroscopicus phosphinothricin, khusus
nya glufosinate amonium
Lycopersicum Gen pengkode S-ade Bakteriofag T3 Penundaan pemasakan
esculentum Nosylmethionine krn biosihtesis etilen ber-
hydrolase kurang
Zea mays Gen pengkode toksin B, thuringiensis Resisten thd pengerek
CrylAb subsp. Kurstaki Batang Ostrinia subilalis
Carica papaya Gen pengkode coat Papaya Ringspot Resisten thd PRSV
protein Papaya Ring- Virus
spot Virus (PRSV)
Glycine max L. Gen pengkode -12 Kedelai Akumulasi as.lemak oleat
Desaturase (fad 2) as.lemak tak jenuh
Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -
Mekanisme tanaman transgenik

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


1.TANAMAN TRANSGENIK TAHAN HAMA

Perakitan Tanaman Transgenik Tahan


Hama Dapat Dilakukan Dengan 2 Strategi

Perakitan Menggunakan Gen Penyandi


Protoxin Yang Di Isolasi Dari Bakteri
Bacillus thuringiensis
Perakitan Menggunakan Gen Penyandi
Inhibitor Protease

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


Protoxin Akan Aktif Bila Termakan Oleh
Kelompok Serangga Lepidoptera, Diptera
Dan Coleoptera.
Protoxin Tidak Aktif di Dalam SeL
Mamalia dan Tidak Berbahaya di Alam
Karena Dapat Terdegradasi
Inhibitor Protease Bila Termakan Oleh
Serangga Akan Menghambat Kerja
Protease Yang Ada Dalam Serangga,
Sehingga akan Menyebabkan Kematian
Pada Serangga

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


2.TANAMAN TRANSGENIK TAHAN VIRUS

Ketahanan Terhadap virus dapat Dicapai


Dengan Cara :

Menghambat Penyebaran Virus


Menghambat Terbentuknya Virus
Mengatasi Gejala Yang ditimbulkanya

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


METODE PERAKITAN TANAMAN TRANSGENIK
TAHAN VIRUS :

Metode Vaksinasi
Mengunakan Gen Penyandi Protein
Pembungkus Virus.
Protein Pembungkus Virus Yang Dihasilkan
Oleh Tanaman Dapat Mencegah Proses
Replikasi Virus

Contoh : - Virus Mosaik Tembakau (TMV)


- Virus Mosaik Ketimun (CuMV)
- Tobacco Streak Virus
Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -
Metode RNA antisense :

Metode Ini Menggunakan Gen Virus


Penyandi RNA antisense

RNA antisense Dapat Membentuk Utas


Ganda Dengan mRNA Normal
RNA antisense-mRNA Akan Menghalangi
Ribosom Untuk Melakukan Proses Translasi
Tanaman Yg Mengekspresikan RNA
Antisense Akan resisten Terhadap Infeksi
Virus
Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -
3. TANAMAN TRANSGENIK TAHAN
HERBISIDA

Strategi perakitan Tanaman Tahan


Herbisida :
Menghambat Pengambilan Herbisida
Menghasilkan Protein Yang Menjadi Sasaran
Herbisida
Menurunkan kemampuan Protein Yang
Menjadi Sasaran Herbisida Untuk Mengikat
Herbisida
Memberi Kemampuan Pada Tanaman Untuk
Mendegradasi Herbisida
Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -
Contoh :

Tanaman Tahan Terhadap Glyphosate


Dirakit Dari Gen Penyandi
5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSPS) Dari
E. coli Yang Resisten Terhadap Glyphosate.
EPSPS Berperan Penting Dalam Sintesis
Asam Amino Aromatik, Yang Merupakan
Sasaran Bagi Herbisida Glyphosate

Tanaman Tahan Herbisida Bromoxynil


Dirakit Dari Gen Penyandi Nitralase Dari
Klebsiella ozaenae Yang Menonaktifkan
Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -
Bromoxynil yg Menghambat Fotosintesis
4. MODIFIKASI KANDUNGAN PADA
TANAMAN

Rekayasa Genetik Dapat Digunakan Untuk :


Kualitas Nutrisi Dengan Memodifikasi
Kandungan Asam amino
Memodifikasi Komposisi Asam Lemak Pada
Tanaman Penghasil Minyak
Rasa Buah/Sayuran Dengan Mengekpresikan
Monellin Yang Merupakan Sebuah Protein
Berasa Manis

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -


5. MODIFIKASI PIGMEN PADA BUNGA

Warna Bunga Dapat Direkayasa Dengan


Memodifikasi Gen Penyandi Enzim Yang
Terlibat Dalam Biosintesis Flavonoid.
Flavonoid Adalah Pigmen Bunga Yang paling
Umum dan Disintesis Dari Phenylalanin
Melalui Beberapa Seri Reaksi Yang Dikatalis
Oleh Enzim.
Warna Bunga Ditentukan Oleh Rantai Kimia
Yang Terdapat Di sisi Dari Pigmen

Bioteknologi Farmasi, F. MIPA Universitas Pakuan -