ELEKTROFORESIS

Persiapan pereaksi
Akrilamida: bis-akrilamida 30% dibuat dengan cara
mencampurkan 87,6 gram akrilamida dan 2,4 g bis-
metilen akrilamida dalam 300 mL air.
Tris-HCl 1,5 M; pH 8,8 dibuat dengan cara melarutkan
sebanyak 27,23 g basa Tris dengan 80 mL air,
kemudian pH nya diatur sehingga tepat 8,8 dengan
HCl 1 N, lalu tambahkan air sampai volume larutan
150 mL
Tris-HCl 0,5 M; pH 6,8 dibuat dengan cara melarutkan
sebanyak 6 gram basa Tris dengan 60 mL air,
kemudian pH nya diatur sampai 6,8 dengan HCl 1 N,
lalu tambahkan air sampai volume larutan 100 mL.
 Elektroforesis merupakan suatu cara
untuk memisahkan fraksi-fraksi
campuran berdasarkan atas
pergerakan partikel-parikel koloid
yang bermuatan dibawah pengaruh
medan listrik.
Elektroforesis banyak digunakan
untuk menganalisis asam nukleat,
virus, enzim dan protein
 Dalam larutan, ptotein enzim akan bermuatan yang tergantung
pada pH larutan dan titik isoelektrik (PI) enzim.
Pada titik isoelektriknya, protein tidak bergerak dibawah
pengaruh medan listrik.
Pada keadaan pH di bawah PI protein bergerak sebagai kation
dimana kecepatannya naik bersamaan dengan turunnya pH,
kation ini akan bergeerak ke arah elektroda negatif.
Jika pH di atas PI protein bergerak sebagai anion dan
kecepatannya akan naik bersamaan dengan meningkatnya pH,
anion ini akan bergerak ke elektroda positif.
 SDS 10%. Dibuat dengan cara melarutkan
sebanyak 10 gram SDS dalam 100 mL air.
Bufer sampel dibuat dengan cara
mencampurkan zat-zat berikut
a. Air (aquades) 4,0 mL
b. Tris HCl 0,5 M, pH 6,8 1 mL
c. Gliserol 0,8 mL
d. SDS 10% 1,6 mL
e. Merkaptoetanol 0,4 mL
f. Bromfenol biru 0,2 mL
 Bufer pemisah. Dibuat dengan cara
mencampurkan
a. Basa Tris 30,3 gram
b. Glisin 144,0 gram
c. SDS 10,0 gram
d. Aquades 1,0 liter
 Pembuatan Gel Bawah
NO % Gel 8% 10% 12,5%
1 Akrilamida 30% 4,0 mL 5,0 mL 6,2 mL
2 Tris-HCl 1 M, pH 6,8 6,0 mL 6,0 mL 6,0 mL
3 SDS 10% 150 uL 150 uL 150 uL
4 Air suling 4,86 mL 3,80 mL 2,60 mL
5 Amonium fersulfat 7,2 uL 7,2 uL 7,2 uL
10%
6 TEMED 10 uL 10 uL 10 uL
7 JUMLAH 15 mL 15 mL 15 mL

Semua bahan dicampur, kecuali amonium fersulfat dan

TEMED dicampur saat akan dimasukkan ke dalam cetakan
gel.
 Pembuatan Gel Bawah
NO % Gel 4% 8%
1 Akrilamida 30% 1,3 mL 2,0 mL
2 Tris-HCl 1 M, pH 6,8 1,2 mL 1,2 mL
3 SDS 10% 100 uL 100 uL
4 Air suling 7,2 mL 7,2 mL
5 Amonium fersulfat 5,0 uL 5,0 uL
10%
6 TEMED 10 uL 10 uL
7 JUMLAH 10 mL 10 mL

Semua bahan dicampur, kecuali amonium fersulfat dan

TEMED dicampur saat akan dimasukkan ke dalam cetakan
gel.
 PRINSIF UMUM
ELEKTROFORESIS
Pemisahan senyawa dengan
elektroforesis dilakukan berdasarkan
perpindahan molekul bermuatan
karena pengaruh medan listrik.
Menurut Stoke, koefesien gesekan f
adalah:
f = 6 nrv
v q
x 6 nr
n= viskositas
r = jari-jari
 Mobilitas elektroforesisterutama
tergantung pada kekentalan medium
(n), ukuran molekul (r) dan muatan
molekul (q)
Jenis elektroforesis
Faktor faktor yang
mempengaruhi perpindahan
parrtikel yang bermuatan dalam
medan listrik :
1. Sifat partikel
a. besaran fisis dari ion (BM)
b. besaran muatan
c. tanda dari muatan
2. Sifat dari larutan bufer
3. Sifat dari medan listrik
 Macam macam elektroforesis :

1. Elektroforesis kertas
2. Elektroforesis agar
3. Elektroforesis gel poliakrilamid
A. Elektroforesis disk gel akrilamid
B. Elektroforesis gel - SDS
1. Elektroforesisi Kertas

Biasa digunakan dalam analisis dan

pemisahan molekul kecil
Jarang digunakan untuk pemisahan
makromolekul karena penyerapan
dan tegangan permukaan yang
terjadi mengakibatkan denaturasi
molekulnya sehingga pemisahan
tidak sempurna
2. Elektroforesisi Gel
Untuk mendapatkan hasil yang memuaskan,
gel harus mempunyai sifat sifat sebagai
berikut :
1. Gel harus tetap pada tingkat elastisitas
tertentu meskipun konsentrasi zat sangat
rendah
2. Gel dibuat dalam medium cair sehingga
tidak terjadi efek elektroosmosis atau efek
lain yang disebabkan oleh gugus ionik
dalam medan listrik
3. Gel harus transparan agar endapan yang
terbentuk terlihat jelas (visible)
3. Elektroforesisi Gel Poliakrilamid
Elektoforesis gel poliakrilamid atau disk
eletroforesis adalah metode pemisahan yang
menggunakan kolom vertikal yang berisi medium
penyangga yang dibuat dari reaksi polimerisasi
akrilamida dan bis-akrilamid yang dikatalisis
ammonium fersulfat dan tetrametiletilendiamin
(TEMED).
SDS dan betamerkaptoetanol digunakan untuk
mereduksi ikatan disulfida membentuk gugus
sulfidril yang dapat mengikat SDS sehingga
protein bermuatan negatif dan bergerak kearah
kutub positif
Untuk pemisahan protein dan asam
nukleat pada pH 2 10.
Ukuran pori pori gel tergantung
konsentrasi poliakrilamid

Akrilamid (%) Berat Molekul

3,75 106
7,5 3 x 105
15 30 104
Berdasarkan pengukuran difusi, ternyata
ada hubungan antar persentase akrilamid
dengan ukuran pori pori gel

Poliakrilamid (%) Ukuran Pori Pori

3 4,4
5 3,6
10 2,6
20 1,8
30 1,3
B. Elektroforesis gel PAG- SDS

Sistem ini digunakan untuk

memisahkan dan mangkarakterisasi
jumlah maupun ukuran rantai
polipeptida atau subunit protein
Terjadi reduksi jembatan S-S oleh tiol
dan rusaknya semua organisasi
subunit protein oleh SDS (sodium
Dodesil Sulfat) dalam larutan bufer
yang mengandung poliakrilamid
yang berkadar tinggi.
Gel poliakrilamid berfungsi
sebagai penyaring molekuler
sehingga viskositas dan ukuran
pori gel akan menentukan
mobilitas protein atau subunit
yang telah terdenaturasi
tersebut
ELEKTROFORESIS SLAB
Teknik gel Slab , akrilamid
dipolimerisasi ke dalam slab
berbentuk segiempat diantara dua
plat kaca (lihat gambar).
Sampel dimasukkan pada sisi atas
gel dengan bantuan alat berbentuk
sisir.
Keuntungan teknik ini adalah
sampel bisa dibandingkan karena
semua sampel terdapat dalam gel
yang sama dengan kondisi yang