Anda di halaman 1dari 22

HPLC (High

Performance Liquid
Chromatography)
HPLC
HPLC atau disebut KCKT dikembangkan
pd akhir thn 1960-an & awal thn 1970-
an
KCKT paling sering digunakan untuk
menetapkan kadar senyawa2 trtntu
(asam amino, asam2 nukleat, protein2
dlm cairan fisiologis, menentukan
kadar senyawa2 aktif obat,
memurnikan senyawa dlm dlm suatu
campuran, memisahkan polimer, dll.
Prinsip Dasar HPLC
HPLC sebuah instrument yg menggunakan
prinsip kromatografi dgn menggunakan fase
gerak cair dialirkan melalui kolom (fase
diam) detektor (bantuan pompa).
Sampel dimasukkan ke dlm fase gerak dgn
cara penyuntikan
Pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran
yg berbeda
Senyawa yg keluar dari kolom dideteksi oleh
detektor dan direkam dlm bentuk
kromatogram
Kegunaan HPLC/KCKT
Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,
maupun seny.biologis
Analisis senyawa tdk mudah menguap (non
volatile)
Isolasi dan pemurnian senyawa
Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir
sama
Pemisahan seny2 dlm jml sedikit sekali
(trace elements)
Menetapkan kadar seny2 tertentu
Kelebihan
HPLC/KCKT
KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan
senyawa berbobot molekul tinggi.
KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg
sebagian besar non volatile.
KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar
sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan
panas
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan
mencampur pelarut dalam berbagai gradient
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Instrumentasi KCKT
Intrumentasi HPLC terdiri dari wadah fase gerak,
pompa, injektor, kolom, detektor, dan pengolah data.
Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerah harus bersih dan
lembam (inert)
Wadah ini biasax dpt menampung fase
gerak antara 1-2 L pelarut
Sebelum fase gerak digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan
gas) yg ada pd fase gerak
Fase gerak harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari adanya
partikel2 kecil
Fase Gerak
Fase gerak/eluen berupa zat cair. Selain
sbg pembawa seny.campuran menuju
detektor, fase gerak harus dpt
berinterakasi dgn solut2.
Syarat yg harus dimiliki oleh fase
gerak :
Kemurnian tinggi (high purity)
Kestabilan tinggi
Kekentalan rendah
Dapat melarutkan sampel
Fase Gerak..
Berdasarkan kepolaran fase gerak
dibandingkan fase diamnya, fase
gerak dibedakan menjadi 2, yaitu:
Fase normal Fase diam lebih polar
Fase terbalik Fase diam kurang polar
Pompa pd KCKT
Pompa yg cocok digunakan pd KCKT harus inert
terhadap fase gerak
Bahan yg umum dipakai untk pompa; gelas, baja
tahan karat, teflon, batu nilam
Pompa yg digunakan sebaikx mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dgn kec.alir 3mL/menit
Tujuan penggunaan pompa atau sist.penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, bebas dri gangguan
Pengembangan (Elusi)
Seperti kromatografi lain, elusi adalah
proses fase gerak membawa sample
menelusuri kolom.
Elusi dapat dilakukan dg 2 cara yaitu;
Elusi Isokratik Fase Gerak dgn polaritas sama
Elusi Bergradien Fase gerak dgn polaritas
berubah
Elusi bergradien ini digunakan untuk
memperoleh pemisahan (puncak) yang
lebih baik.
Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang
utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100
l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom..
Dalam prakteknya, kolom mikrobor
tidak setahan kolom kovensional dan
kurang bermanfaat untuk analisis
rutin
Detektor pd KCKT

Detektor dikelompokkan menjadi 2, yaitu;


detektor universal dan detektor yg spesifik
Detektor yg ideal mmpunyai karakteristik sbb:
Respon trhdp solut cepat
Sensitifitas tinggi
Stabil dlm pengoperasian
Sel volume kecil
Tdk peka terhdp perubahan suhu dan kec.alir fase gerak
Kolom
Performance kolom menurun seiring dengan
lamanya waktu penggunaan, yang ditandai
dengan peningkatan backpressure dan lebar
puncak kromatogram
Untuk pengoperasian kolom, Selalu flush (aliri)
kolom dengan pelarut kuat (strong solvent)
seperti metanol sebelum digunakan untuk
mengeliminasi setiap anlit yang tertahan kuat
Jangan pernah biarkan komponen bufer
tertinggal dalam dalam pompa atau kolom,
Pencucian Kolom

Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.


Untuk kolom Reversed-phase:

gunakan campuran 96% diklorometan dan


4% metanol dengan 0,1% amonium
hidroksida
Untuk kolom Normal-phase:
gunakan metanol
Jenis-Jenis Detektor
Jenis-jenis KCKT
Kromatografi
Jenis-jenis KCKT
Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya


ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada
rekorder.
Aplikasi HPLC dlm Kehidupan

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada


industri farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar
sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan
partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar
ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat
berpori
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan
dengan rezin Zipax-SAX.
Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan
masalah-masalah biokimia.
Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan
untuk memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya
terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan

Anda mungkin juga menyukai