Anda di halaman 1dari 14

Metode Trypan Blue

Exclusion
Makbruri
PMIB FK UI
Pertanyaan
Jelaskan tentang cara menghitung
jumlah sel punca hidup dengan
tryphan blue exclusion ?

Jelaskan prinsip kerja tryphan blue?


Tryphan Blue Exclusion
Prinsip Kerja
Metode dye exclusion merupakan metode
tradisional yang digunakan untuk
menghitung sel hidup, penggunaan tryphan
blue menjadi metode yang paling umum
digunakan.
Tryphan Blue merupakan pewarna yang
penting dalam membedakan sel yang hidup
dengan sel yang tidak hidup.
Sel yang hidup tidak akan terwarnai oleh
Tryphan Blue, sedangkan sel yang mati akan
terwarnai dengan tryphan blue dan akan
terlihat warna biru di bawah mikroskop
Tryphan Blue Exclusion
Prinsip Kerja
Sel yang masih hidup mempunyai membran sel
yang intak oleh karena itu tryphan blue tidak
akan bisa menembus membran sel dan tidak
akan memberi warna terhadap sel
Sel yang sudah mati tidak mempunyai
membran yang intak oleh karena itu tryphan
blue dapat menembus membran sel dan akan
memberi warna biru terhadap sel.
Di bawah mikroskop sel yang hidup akan
terlihat bening karena tidak menyerap zat
warna, sedangkan sel yang mati akan berwarna
biru dan terlihat membengkak dibandingkan sel
yang hidup.
Tryphan Blue Exclusion
Metode
Metode
Cara hitung sel secara
tradisional ini
menggunakan
hemocytometer (Kamar
Hitung) yang biasanya
digunakan untuk
menghitung sel darah,
alat ini tebal, terdiri dari
ruang-ruang sehingga
suspensi sel akan masuk
ke dalamnya dan sel
dapat dihitung .
Tryphan Blue Exclusion
Metode
A. Metode (Persiapan Sampel)
1. Siapkan dilusi suspensi sel menggunakan PBS atau
serum-free Medium, Contoh langkah-langkahnya:
a. Tambahkan 80 L PBS atau serum free medium ke
dalam tube microcentrifuge
b. Tambahkan 20 L well mixed sel suspensi ke dalam
tube microcentrifuge yang berisi medium tadi.
c. Siapkan 0,4 % Trypan Blue masukan ke dalam tube
yang baru
d. Tambahkan 20 L well mixed dilusi sel suspensi ke
dalam tube yang berisi 20 L 0,4 % Trypan Blue ,
campur dan biarkan 5 menit dalam suhu ruangan
(Untuk mendapatkan keakuratan dalam menghitung sel
yang hidup disarankan sel dihitung tidak lebih dari 15
menit setelah diwarnai dengan Tryphan Blue)
Tryphan Blue Exclusion
Metode
2. Sebelum digunakan cuci hemocytometer
mengunakan ethanol 70 % dan tunggu kering
3. Cuci coverslip dengan ethanol 70% , biarkan
kering dan letakan di atas kamar hitung
hemocytometer
4. Letakkan 15 L suspensi sel ke tepi dari kamar
hitung diantara coverrslip, bangunan yang
berbentuk seperti huruf V. Biarkan suspensi
mengalir dengan capillary action
5. Tunggu Hingga satu dua menit kemudian
hitung
Tryphan Blue Exclusion
Hemocytometer
Tryphan Blue Exclusion
Metode Hitung Sel
Kamar Hitung dari
Hemocytometer dibatasi oleh
suatu tepi garis yang
mengindentifikasi suatu area
kamar hitung. Area ini
memiliki kedalaman 0,1 mm
dan mempunyai 4 pojok yang
mirip yang digunakan untuk
menghitung sel. Setiap
daerah ini memiliki batas
1mm x 1mm dimensi luasnya
dan terdiri dari 16 persegi
kecil, sehingga masing-
masing kamar pojok ini
memiliki luas 0,1 mm3 atau
Tryphan Blue Exclusion
Metode Hitung Sel
1. Fokus pada daerah yang telah
ditentukan untuk dihitung,
gunakan perbesaran 10x objective
2. Hitung jumlah sel, baik yang hidup
(unstained) ataupun yang mati
(terwarnai) di setiap ujung-ujung
kamar hitung (A,B,C,D). Ambil nilai
rata-rata dari keempat kamar
hitung tersebut dan dikalikan
dengan 10^4 untuk mendapatkan
jumlah sell per ml dalam sampel
yang dimasukan ke dalam
hemocytometer
3. Dikalikan dengan dua berdasarkan
faktor pengenceran (1:1) terhadap
trypan blue
Tryphan Blue Exclusion
Metode Hitung Sel
4. Untuk mendapatkan jumlah total sel yang hidup
dan Tidak Hidup /ml dapat digunakan rumus :
(A+B+C+D)/4 x 10^4 X2
5. Persentase sel yang tidak terwarnai
menunjukkan sel yang hidup di dalam suspensi
dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
% Sel yang hidup = Jumlah Sel Yang Hidup
x100
Seluruh Jumlah Sel
REFERENSI
1. Louis SK, Siegel CA. Cell Viabilty Analysis
Using Trypan Blue in Mammalian Cell Viability
Methods and Protocol. Springer.2011
2.http://www.humanimmunologyportal.com/pr
otocols/performing-cell-counts-with-a-
hemacytometer
3. Marchenko S, Flanagan L, Counting Human
Neural Stem Cell. Journal of Visualized
Experiments. 2007 Avaible at
http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262
TERIMA
KASIH