UNIVERSIDAD NACIONAL DE JAN

FACULTAD DE TECNOLOGIA MDICA

ENFERMEDAD DE CARRION
 HISTORIA
Perodo Preinca-Inca
Perodo del siglo XIX
Se han encontrado
huacos de cermica La descripcin por primera
antropomrfica con vez de la verruga peruana
lesiones verrucosas, de (verruga andcola) como
las culturas Mochica, una nueva enfermedad la
Chim as como en 4
realiza Toms Salazar en
monolitos de la cultura
Huaylas. 1858.

En 1531 Pedro Pizarro El hito ms importante y

describe una epidemia de trascendental en la historia
verrugas en Coaque, zona de la Bartonelosis, fue el
costera del Ecuador que experimento de Daniel
afect a los espaoles. Alcides Carrin
CONSTRUCCIN DEL FERROCARRIL CENTRAL
 1885 1913

DANIEL ALCIDES CARRION ALBERTO BARTON

Fiebre de la Oroya y Cuerpos
Verruga Peruana, dos endoglobulares.
fases de una misma Richard Strong
enfermedad. propone el nombre de
Bartonella
baciliformis.
 VECTOR:LUTZOMIA SPP.
Mosquitos.
Hbitat: 500-3200 msnm
En Per: (sierra)
L. verrucarum
L. peruensis
En Jan- Bagua (selva)
L. robustus
L. maranonensis
EPIDEMIOLOGIA
 MICROBIOLOGIA
La Bartonella baciliformis es una bacteria
gram negativa pequea, (0.3-0.5 umde
ancho, 1-1.7 um de largo).
Intracelular facultativo.
Cocobacilo pleomorfico, aerobica, no
fermentadora.
Catalasa y oxidasa negativa.
Movil con flagelos polares.
INVASIN DE LA CLULA ENDOTELIAL Y ERITROCITOS
 INMUNIDAD E INFECCION
Un factor que complica el aclaramiento de la bacteria es el
comportamiento intra-eritrocitarios de Bartonella siendo protegida
de la respuesta inmune celular y humoral debido la falta de
molculas del complejo mayor de histocompatibilidad en superficie
del eritrocito maduro.
Los eritrocitos no pueden presentar los antgenos de sus invasores
al sistema inmune.
ASPECTOS CLINICOS
 FASE AGUDA
Fiebre de la Oroya
Anemia severa.
Ictericia.
Hepato y Esplegnomegalia.
Linfoadenopatas.
Transtornos de conciencia (somnolencia-coma)
INFECCIONES OPORTUNISTAS: Salmonella typhi y no typhi,
toxoplasma, histoplasmosis diseminada y sepsis debida a Shiguella,
Staphylococcus y Enterobacter, Pneumocystis, etc.
 FASE INTERCALAR
Se detiene la hemolisis.
Desaparicin de sntomas y signos.
Bacteriemia ausente.
Duracin aproximada de 1-3 semanas (hasta meses)
 FASE CRONICA
Poblacin peditrica de reas endmicas, sin que hayan tenido un
cuadro tpico de fase aguda.
Las lesiones afectan piel y mucosas, no se han detectado en
vsceras.
Estas son de superficie lisa, no dolorosas, de color rojo violceo y
pueden sangrar fcilmente.
 VERRUGA PERUANA
TIPO MILIAR TIPO MULAR TIPO NODULAR
 COMPLICACIONES GESTANTES
PARTO PREMATURO
OBITO FETAL
PURPURA
NEUROBARTONELLOSIS

NEUROBATONELLOSIS: Hipoxia severa por anemia y

presencia de parsitos, tendran mayor contacto con
el endotelio cerebral produciendo lesiones tisulares,
reaccin parnquima y exudados.
 EL DIAGNOSTICO
El diagnstico en la fase aguda
puede ser realizado usando el frotis
de sangre perifrica teido con
Giemsa.
Es posible observar los bacilos
dentro de los eritrocitos.
DIAGNOSTICO: FROTIS SANGRE ERIFERICA
FORMAS BACILARES FORMAS COCOIDES
COMPROMISO HEMATOLOGICO
 DIAGNSTICO PROCEDIMIENTO DE
LABORATORIO
PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIN DE MUESTRAS.
La efectividad y xito del diagnstico bacteriolgico depende en gran medida de la obtencin y el
transporte oportuno de las muestras al laboratorio, por esta razn el equipo de salud involucrado debe
entender la naturaleza crtica de mantener la calidad de las muestras durante todo el proceso.
1. Para el diagnstico directo:
Frotis sanguneo de sangre perifrica en lminas portaobjetos.
2. Para aislamiento - cultivo:
Sangre total con anticoagulante en tubos al vaco con citrato de sodio, heparina o EDTA.
Sangre total inoculada directamente al medio de cultivo bifsico (inmediatamente despus de la
extraccin de la muestra sangunea).
Biopsias de las lesiones, colocadas en recipiente estril.

3. Para diagnstico histopatolgico:

Biopsias de las lesiones en formol al 10%
 MUESTRAS DE SANGRE
Para la obtencin de muestras de frotis sanguneo y sangre total seguir las
indicaciones del Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y
envo de muestras
ERRORES COMUNES AL PREPARAR LAS MUESTRAS DE FROTIS SANGUINEO

1. No colocar la cantidad adecuada de sangre en la lmina. El tamao de la gota para hacer el frotis
sanguneo, idealmente es una gota similar a aquella formada cuando se hace una gota con una aguja
hipodrmica N 21.
2. No usar lminas con grasa (sin lavar) para hacer el
frotis.

3. No usar lminas mal enjuagadas.

4. No usar lminas con borde astillado o irregular para

hacer el frotis.
5. No guardar las muestras inadecuadamente.

6. No preparar las muestras sobre lminas rayadas.

7. No colorear las muestras mucho tiempo despus

de haberlas obtenido.
 OBTENCIN DE MUESTRAS DE TEJIDOS MEDIANTE BIOPSIAS DE
ERUPCIONES O VERRUGAS.

Materiales para la obtencin de biopsias

Fichadeinformacinbsica.
Fichasdeconsentimientoinformado.
Sacabocados dermatolgico (punch), de diferentes
dimetros,segneltamaodelalesin:#3,#4,#5,#6
y#8.
Frascosestrilesconformolal10%.
 PROCEDIMIENTOS

COLORACIN DEL FROTIS SANGUNEO CON

GIEMSA
La coloracin de Giemsa es una modificacin de la
coloracin de Romanowsky, est disponible en
cualquier laboratorio y nos permite detectar los
glbulos rojos infectados por Bartonella
bacilliformis en sus formas bacilares,
cocobacilares o cocoides. La muestra debe ser
fijada con metanol antes del proceso de tincin
 PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIN DE LA MUESTRA SANGUNEA

1. Colocar la varilla de vidrio sobre un lavatorio o recipiente, para facilitar la

eliminacin de los lquidos usados en la coloracin.
2. Se colocan las lminas con los frotis sanguneos, previamente fijados sobre
la varilla, separadas una de otra para poder manipularlas con seguridad.
3. Se cubre la extensin con el colorante de trabajo diluido 1:10 por 15
minutos. (La dilucin y el tiempo de coloracin se ajusta de acuerdo con las
caractersticas del colorante preparado).
4. Descartar el colorante y lavar la lmina a chorro suave y continuo de agua de
cao hasta que arrastre todo exceso de colorante.
5. Colocar las lminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y
dejar secar a temperatura ambiente.
6. Proteger el frotis del polvo.
 COLORACIN MEDIANTE LMINA INVERTIDA
1. Colocar a bandeja de coloracin sobre una superficie plana de preferencia cerca de un lavatorio.
2. Colocar las lminas fijadas con metanol que se van a colorear en forma invertida, es decir, con la muestra del frotis
hacia abajo.
3. Entre lmina y lmina debe haber una distancia tal que permita correr o agregar el colorante a cada una de las
lminas.
4. Vaciar el colorante de trabajo a la altura de cada lmina sobre la bandeja y dejar fluir el colorante por debajo de cada
una de ellas.
5. En esta forma de coloracin, el precipitado del colorante se va al fondo de la bandeja quedando la superficie en
contacto con el frotis, libre de precipitado.
6. Dejar colorear por 15 - 20 minutos
7. Descartar el colorante y lavar la lmina a chorro suave y continuo de agua de cao hasta que arrastre todo el
exceso de colorante.
8. En este procedimiento el colorante de la bandeja puede ser reusado hasta por tres veces.
9. Colocar las lminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y dejar secar a temperatura ambiente.
 FUNDAMENTO DE COLORACIN GIEMSA

La eosina es un tinte cido, por lo que unir estructuras bsicas como el

citoplasma o los eritrocitos. Por otra parte el azul de metileno tiene un pH bsico y
unir estructuras y molculas cidas, como el ADN, por lo que teir de azul o
purpura los ncleos. Las bacterias al tener su ADN en el citoplasma se tien de
azul por completo. Otras estructuras celulares, cuyo pH no sea tan extremo como
el ADN pueden adquirir coloraciones entre el azul y el prpura. El pH del tinte debe
estar equilibrado entorno al 6,5 para que la tincin no est descompensada.
 OBSERVACIN Y LECTURA MICROSCPICA DE LOS
FROTIS SANGUNEOS

1. En la lectura se debe tener en cuenta:

a) ndice de bacteriemia
b) Forma de las bacterias
2. Se lee de 50 a 100 campos por lmina con la muestra de frotis sanguneo a 1000 aumentos.
3. Las formas cocoides se encuentran en pares o cadenas. Si se observa un solo hemate con forma cocoide es preferible revisar
toda la lmina, es posible que no sea la forma cocoide sino algn artefacto.
4. En un frotis positivo, se observan hemates deformados y muchas veces toman la forma ameboide.
5. El resultado de la lectura del frotis sanguneo se expresa en porcentaje de hemates infectados, para lo cual se cuenta 100
hemates y se determina cuntos estn infectados.
6. Si se observa que las clulas infectadas son ms del 50%, se leern 50 campos.
7. Si se observa que las clulas infectadas son menos del 50%, se leern 100 campos.
8. Si se observa que el porcentaje de hemates infectados es menor a 5%, se debe leer toda la lmina.
9. En el reporte se debe colocar las formas bacterianas observadas, ya sea bacilar, cocobacilar o cocoide.
10. En la fase aguda de la enfermedad se observan predominantemente formas bacilares de color rojizo o violeta, separadas o en
grupos dentro de los hemates; con menos frecuencia se ven formas cocoides.
ERRORES DURANTE LA LECTURA DE LMINAS
Los errores ms frecuentes son confundir las formas
cocoides con punteado bsofilo, precipitados del
colorante, clulas de Heinz o con reticulocitos en los
cuales se colorea el ncleo.
 DIAGN
El aislamiento de Bartonella bacilliformis se puede realizar en los siguientes medios:
1. En agar Columbia con sangre de carnero al 10% en placas Petri.
2. En medio de cultivo bifsico distribuido en frascos, constituido por una fase slida de agar Columbia con
sangre de carnero al 10% y extracto de levadura al 0,1% y una fase lquida con medio RPMI suplementado
con suero fetal bovino; una alternativa para la fase lquida es el medio RPMI sin suplemento o infusin
cerebro corazn.
3. El mayor porcentaje de aislamientos (70-80%) se logra en las dos primeras semanas de incubacin, en la
tercera y cuarta semana se obtiene el resto (20-25%).
MATERIALES PARA EL CULTIVO
Jeringa descartable con aguja.
Alcohol de 70.
Algodn.
Guantes estriles.
Contenedor de material contaminado.
Estufa de 28 a 29C.
Pipetas de transferencia descartables estriles.
Tubos al vaco conteniendo la muestra de sangre
total.
Medios de cultivo.
PREPARACIN DE LA MUESTRA SANGUNEA
Para incrementar el aislamiento de B. bacilliformis de la sangre es conveniente lisar los eritrocitos por
medios mecnicos como el de centrifugacin de la muestra.

PROCEDIMIENTO PARA EL CULTIVO EN PLACAS:

Colocar en la cabina de seguridad el material necesario para el cultivo de la muestra sangunea.
1. Dejar que los medios de cultivo tomen temperatura ambiente.
2. Rotular con el cdigo del paciente las placas con agar Columbia sangre.
3. Desinfectar con alcohol de 70 la tapa de jebe del tubo al vaco que contiene la muestra.
4. Extraer la muestra con una jeringa, a travs de la tapa de jebe o con pipeta de transferencia.
5. Inocular de 0,5 a 1mL de sangre sobre el agar Columbia, dejando que la sangre fluya sobre la
superficie del medio, luego cerrar la placa.
6. Colocar la placa con la muestra sembrada en bolsas de polietileno de baja densidad
autosellables para mantener la humedad del medio de cultivo que debido al largo
perodo de incubacin se seca y para evitar contaminacin con hongos saprofitos.
7. Incubar el cultivo a 28 C hasta por 45 das.
8. En el caso que el laboratorio no tenga las facilidades ideales para poder realizar el
cultivo sin correr el peligro de contaminarlo, se debe usar un mechero de gas que d a
su alrededor un amplio radio (espacio) de esterilidad o, de lo contrario se debe utilizar
el medio de cultivo bifsico.

 FUNDAMENTO DEL AGAR COLUMBIA

Las peptonas, el extracto de carne y el extracto de levadura
proporcionan condiciones favorables de crecimiento para el
aislamiento de microorganismos exigentes. El almidn y Con
el agregado de 5-10 % de sangre (de carnero, de caballo), se
logra una buena observacin de las reacciones hemolticas
ya que la bacteria Bartonella baciliformes no hemolisa los
hemates.
 PROCEDIMIENTO PARA EL CULTIVO EN MEDIO BIFSICO:
1. Extraer con una jeringa la sangre total del tubo que contiene la muestra de sangre.
2. Inmediatamente, inocular a travs del tapn de jebe 0,5 a 1mL de sangre al frasco con medio de cultivo
baando la fase slida.
3. Este procedimiento debe realizarse cerca de un mechero.- cmara de bioseguridad.
4. Se deja reposar el frasco inclinado hasta que la sangre se impregne en el agar por 30 minutos.
5. Descartar la aguja y la jeringa .
6. Limpiar con un algodn empapado con alcohol la tapa del frasco.
7. Incubar el cultivo a 28-29 C hasta 45 das.

 LECTURA DE CULTIVOS - CULTIVOS EN PLACAS:

1. Examinar los cultivos visualmente con luz transmitida o con una lupa, todos los das hasta por 45 das.
2. Si se ve desarrollo de colonias entre las 24 y 72 horas, no se trata de B. bacilliformis. Gram y bioquimica.
3. En el aislamiento primario las colonias de B. bacilliformis se desarrollan entre cuatro das a seis semanas de
incubacin, crecen lentamente.
4. Son colonias pequeas de apenas 1 mm de dimetro, translcidas tipo roco o blanquecinas. Gram.
5. Bartonella bacilliformis colorea muy dbilmente con la tincin de Gram.
6. Realizar un subcultivo de las colonias sospechosas.
7. Los cultivos pueden ser crioconservados en medio de infusin cerebro corazn con 10% de glicerol a -70 C, en
el Laboratorio de Referencia Regional o Nacional (punto 4.4.).

CULTIVOS EN MEDIO BIFSICO

1. En el caso del medio bifsico, baar la fase slida del medio con la fase lquida
2. Si a las 24 48 horas se nota desarrollo de colonias sobre el plano inclinado de la
fase slida o se nota turbidez o lisis de los hemates en la fase lquida.
3. Si se observa crecimiento de colonias, turbidez o hemlisis despus de seis a siete
das de incubacin, realizar un subcultivo en placas con agar Columbia sangre.
4. Si no se observa crecimiento de colonias o turbidez despus siete u ocho das,
realizar subcultivos ciegos a los 15 das.
5. Los cultivos deben seguir incubndose hasta por 45 das.
6. Si se carece de una incubadora de la temperatura indicada-T ambiente y enviarlos.
 SUBCULTIVOS
1. Los subcultivos deben realizarse en cabina de bioseguridad.
2. Desinfectar la tapa del frasco de hemocultivo con alcohol 70 .
3. Con una jeringa de tuberculina estril, extraer 200 L de la fase lquida del medio e inocular en la
superficie de placas con agar Columbia sangre y colocar una gota sobre una lmina para hacer un frotis
y coloracin Gram.
4. Los subcultivos tambin pueden realizarse en frascos con medio bifsico.
5. Observar la lmina coloreada con Gram y buscar formas bacterianas.
6. Incubar los cultivos a 28-29 C y observar hasta por 45 das.
7. Observar los cultivos con luz transmitida todos los das.
8. En el caso que se haya realizado la siembra primaria en placas con agar Columbia y se noten colonias
sospechosas, puede hacer un cultivo en medio bifsico.
 LECTURA DE LOS SUBCULTIVOS:
Despus de varios pasajes de cultivos o subcultivos sucesivos, el crecimiento de las
colonias es ms rpido y se hacen visibles despus de tres a cuatro das de incubacin.
Generalmente, las colonias crecen entre los 4 y 14 das; sin embargo, debe observarse el
subcultivo hasta los 45 das.

IDENTIFICACIN DE BARTONELLA BACILLIFORMIS
La identificacin del gnero se realiza por:
1. Las condiciones requeridas para el desarrollo bacteriano, como:
La temperatura de crecimiento, entre 28 - 29 C.
El perodo de incubacin, desarrolla desde los 4 hasta 45 das.
Desarrolla slo en medios enriquecidos.
El aislamiento primario es lento.


2. No produce hemlisis en agar Columbia con sangre de carnero.

3. Son Gram negativos.
4. Las colonias son pequeas, puntiformes y translcidas, de borde entero;La morfologa de la colonia y las
caractersticas de crecimiento probablemente estn relacionadas con la patogenicidad del microorganismo.
5. No crecen en medio de agar Mac Conkey o agar nutritivo.
6. No fermentan los azcares, son bioqumicamente inertes.
7. No crece a 37 C.
8. Son oxidasa negativa, catalasa positiva, ureasa e indol negativo.
9. Son mviles, lo que se observa en el medio de gel de fases, forman una banda de desarrollo bacteriano de
aproximadamente 6 mm, con migracin del cultivo desde el trazo de inoculacin hacia las paredes del tubo.
 CRIO CONSERVACIN DE LAS CEPAS
Los aislamientos que tengan caractersticas compatibles a B. bacilliformis deben ser
almacenados bajo condiciones de crioconservacin.
Procedimiento:
1. Si el subcultivo es en placa: Si se tienen subcultivos positivos y con colonias de un solo tipo,
coger con una asa de siembra las colonias (cosechar) e inocularlas en crioviales con medio
infusin cerebro corazn con glicerol 10%.
2. Si el subcultivo es en medio bifsico: Coger con una pipeta estril de 0,5 - 2 mL de la fase
lquida del medio e inocularlas en crioviales.
c. Las cepas deben guardarse por duplicado o ms a -20 o -70 C
CORTE HISTOPATOLOGICO

La angiomatosis
bacilar (AB) es
una enfermedad
poco frecuente,
secundaria a la
infeccin por dos
especies de
bacilos Gram
negativos del
gnero Bartonella
: Bartonella
henselae y Barton
ella quintana.
 HEMATOXILINA-EOSINA: FUNDAMENTO DE LA
COLORACIN
La Eosina es un colorante cido (predomina densidad de carga negativa), por lo
cual se asocia y colorea a estructuras catinicas del citoplasma y matriz
extracelular, tales como: filamentos citoplasmticos (como los de clulas
musculares); membranas intracelulares; y fibras extracelulares (por sus
aminocidos bsicos ionizados).

La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante bsico, por
lo cual se asocia y colorea estructuras aninicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o
carboxilos ionizados):
Heterocromatina y nuclolos
RNA ribosomal
Matriz extracelular.
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el
substrato conocido especfico (bacteria) sobre l se coloca el suero de quien se
sospechalapresenciadeanticuerposespecficos,silareaccinespositivasedar
formacindecomplejoantgeno-anticuerponovisibleyaqueelanticuerponoestaba
marcado.

Segunda etapa: se agrega una anti -inmunoglobulina humana marcada, que

reaccionarconelanticuerpodelcomplejoproducidoenlaprimeraetapa.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PCR. REACCION DE LA CADENA DE POLIMERASA
 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
EXTRACCIN DE ADN

Las extracciones de ADN genmico a partir de cultivos bacterianos y de sangre

total.

Luego, las muestras fueron colocadas en columnas con afinidad por ADN, el ADN
fue atrapado en las columnas y las impurezas se eliminaron mediante soluciones
de lavado; finalmente, el ADN purificado fue eluido de las columnas en 100 mL de
agua bidestilada libre de ADNsas.

La concentracin de ADN de las muestras se midi por espectrofotometra y las

muestras se almacenaron a 4C hasta su uso.
 COMPONENTES DE LA PCR

El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que
queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.

Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa.

Iniciadores de la reaccin: Estas molculas son los cebadores o primers de la reaccin.

Nucletidos libres:
 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma:

En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de
DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalizacin y se lleva a cabo
elevando la temperatura a alrededor de 94C.

El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores
se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se conoce como
hibridacin. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60C.
Por ltimo, en la fase de elongacin o extensin, la enzima polimerasa incorpora nucletidos
complementarios a partir del extremo 3 libre de la regin en que han hibridado los cebadores. La
temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza
Taq polimerasa la temperatura de elongacin suele ser de 72C. Estas tres fases constituyen un ciclo
de la PCR.

Qu se ha obtenido tras un ciclo de PCR?

GRACIAS