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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTIN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y
AGROPECUARIAS

UNIDAD DE SEGUNDA ESPECIALIZACION

CURSO DE MICROBIOLOGIA
AREQUIPA - PERU
2010
CURSO DE
MICROBIOLOGIA
CAPITULO CUARTO

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA
Blgo. Ren Efran Campana Quispe
Ministerio de Salud
E. mail: reneefrain@yahoo.es
EVOLUCION DE LA RESISTENCIA BACTERIANA

Penicillina Methicillina

Penicillin-resistant Methicillin-resistant
S. aureus S. aureus S. aureus (MRSA)
1950s 1970s nosocomial

Vancomicin
MRSA comunidad

1997 1990s
2002
Vancomicin Vancomicin- Vancomicin-resistant
-resistant intermediate enterococco (VRE)
S. aureus (VRSA) S. aureus (VISA)

MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2002;51:565567


Aos
Aspectos histricos de la prueba de
susceptibilidad
1929Alexander Fleming

Cientfico ingls,
descubre, en forma
accidental, la
penicilina
Producida por el
Penicillium notatum
Antecedentes
A partir de 1929, Fleming descubri la penicilina,
poca de los antibiticos
Se produjo incremento de forma exponencial en
la creacin de nuevas clases de estos agentes,
especialmente en pases desarrollados.
En los aos recientes la produccin de nuevos
antibiticos ha disminuido de forma considerable
y ha surgido como un problema de consecuencias
impredecibles la resistencia bacteriana.
ESTRUCTURA BACTERIANA
Bacteria Gram-Negativa, tipica
- Pared y la membrana celular.
- El interior de la clula contiene DNA cromosomal y
- un numero de ribosomas constituido de protenas
y RNA. Los ribosomas estan comprendidos por
subunidades.
ESTRUCTURA BACTERIANA
ESTRUCTURA DE LA PARED DE UNA BACTERIA GRAMNEGATIVA
ACCIN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

Los agentes antimicrobianos se pueden


clasificar en dos grupos, segn su accin
en la bacteria.

Bacteriosttico. Inhiben el desarrollo y la


multiplicacin de las bacterias.
Bactericidas. Matan las bacterias.
Modo de Accin de los Antimicrobianos
Los agentes antimicrobianos son mayormente
clasificados por su especifico modo de accin
frente las clulas bacterianas. Los
antimicrobianos pueden:

Interferir con la sntesis de la pared celular


Inhibir la sntesis de protenas

Interferir con la sntesis de DNA

Inhibir un metabolismo especifico


MODO DE ACCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS
ACTIVIDAD DE BETALACTAMICOS EN BACTERIAS GRAMNEGATIVOS
Betalactamicos entran a traves de las porinas

Los betalactamicos se fijan a una proteina especifica, conocida como


Proteina Fijadora de Penicilina o PBP. Las cuales participan en la sntesis de
la pared celular. La union de betalactamicos a los PBPs bloquean su funcion.
Pared celular debil o defectuosa.

Bacteria se lisa y muere.

PBP
Mecanismos de Resistencia
Antimicrobiana
1. Produccin de enzimas que destruyen al
agente antimicrobiano.
2. Impermeabilidad a la pared celular.
3. Sitio de unin modificado.
4. Bomba de eflujo.
5. Vas metablicas modificadas.
Cefalosporina
Mecanismos de Resistencia
Antimicrobiana
BETALACTAMASA EN GRAM
NEGATIVOS

Betalactamicas entran en la
bacteria a travs del canal de
las porinas encontrndose
con las betalactamasas en el
espacio periplasmico.
Las betalactamasas destruyen
las molculas betalactamicas
PBP antes que ellos alcancen su
PBP objetivo
Bacteria es resistente a la
accin de los betalactamicos
Mecanismos de Resistencia
Antimicrobiana
BETALACTAMASA EN
GRAMPOSITIVOS
En bacterias
grampositivas la
produccion de
betalactamasas son
excretadas
extracelularmente.
Los betalactamicos
son inactivados
fuera de la bacteria
Mecanismos de Resistencia
Antimicrobiana
MODIFICACION DE PORINAS
EN GRAMNEGATIVOS
Resistencia a betalactamicos
por barrera a la
permeabilidad
Alteracin del canal de la
porina no tan grande como
para permitir la entrada y
pasaje de las molculas de
los antimicrobianos dentro
de la bacteria
Recordar que los
betalactamicos necesitan
alcanzar la PBP en el interior
de la membrana para ejercer
su accin.
Mecanismos de Resistencia Antimicrobiana
Resistencia adquirida por conjugacin

La bacteria resistente a la
Ciprofloxacina encuentra otra
bacteria gramnegativa con
un plasmido que codifica un
gen de resistencia a
Ampicilina
Al estar bastante cerca, una
estructura pilus se forma.
Una copia del plasmido es
transferido.
El resultado es una bacteria
que es ciprofloxacino y
ampicilina resistente
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
METODOS BASICOS METODOS ESPECIALES
Capacidad Bactericida
Mtodos de difusin Concentracin CBM
Difusin en Agar (Kirby-Bauer) Curvas de letalidad o curvas de
Epsilon Test muerte
Actividad bactericida del suero
Mtodos de dilucin Actividad combinada de
Dilucin en agar antimicrobianos
Dilucin en caldo (concentracin
inhibitoria mnima CIM) Deteccin de mecanismos de
resistencia
Beta-Lactamasas
Resistencia en S. aureus (MRSA,
VISA)
Resistencia en Enterococcus ANRA
PRUEBA DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE
DISCO DIFUSION

PRINCIPIO
La sensibilidad del
microorganismo estar indicada
por el tamao de la zona de
inhibicin del crecimiento
bacteriano
Factores que influyen en la susceptibilidad
antimicrobiana
Composicin del agar
Profundidad del agar
Densidad del inculo
Concentracin del antimicrobiano en el disco
Tiempo de aplicacin de los discos
Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin
pH del medio
Concentracin de Timina y Timidina
Concentracin de cationes divalentes (Ca y Mg)
Reactivos y medios

Medio : - Agar Mueller Hinton MH


- HTM
- MH + 5% de sangre de carnero
Estandar de turbidez (Mc Farland 0.5 )
Inoculo (Muestra problema)
Discos de sensibilidad
Medio: Agar Mueller Hinton
Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las
pruebas de sensibilidad
Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina
Es adecuado para el desarrollo de la mayora de
bacterias patgenas
Existen suficientes datos recopilados que avalas
la experiencia de otras pruebas de sensibilidad
realizadas en este medio
Estandar para la preparacin del
inculo
Se usa una suspensin de sulfato de Bario (0.5
de la escala de Mc Farland)

Preparacin
0.5 ml BaCl2 0.048 M (BaCL22H2O al 1.176% P/V)
99.5 ml H2SO4 0.18 M (0.36N)1% V/V
A= 0.08 0.1 (625 nm)
Conservation: En oscuridad y temperatura ambiente
Verificar la turvidez mensualmente
Preparacin del inculo

Mtodo directo
Mtodo del desarrollo
previo
Seleccin de colonias bien aisladas para
el inculo

Comparacin de la turbidez con


Inoculacin en caldo Meller Hinton la escala Mc Farland 0.5
Inoculacin de la placa
Dentro de los 15 minutos
despus de ajustado el
inculo
Superficie seca del medio
Esperar hasta 3 minutos
antes de aplicar los discos
Colocacin de los discos de
sensibilidad
Colocar los disco con
ayuda de una pinza
Distancia entre discos
mnimo de 25 mm uno
del otro
El dimetro de los
discos segn la OMS
debe ser de 6mm
25 mm
Incubacin
Incubar dentro de los 15 minutos posteriores a
la aplicacin de los discos
Temperatura: 35C
Atmsfera de CO2 Para Haemophilus spp. y
Streptococcus spp.
Tiempo: 16 a 18 horas
24 horas para Staphylococcus spp: Oxacilina y
Vancomicina
Enterococcus spp. Vancomicina
20-24 horas para Streptococcus spp.
Lectura de las placas e
interpretacin de los resultados
Medir los dimetros de
las zonas de inhibicin
Interpretar basndose en
las tablas publicadas por
NCCLS (CLSI)
Se reportara como
sensible (S), intermedio
(I), o resistente (R).
segn corresponda
Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus 25923
Para evaluar la calidad de la prueba de sensibilidad, microorganismos
gramnegativos y grampositivos
Control de calidad de los discos de sensibilidad

Escherichia coli ATCC 35218 (productos de B-lactamasa)


Control de calidad de los discos de combinacin antibitico beta-lactmico/
inhibidor de beta-lactamasa

Pseudomonas aeruginosa ATCC27853


Control de concentracin de cationes divalentes del agar Mueller Hinton
(aminoglucsidos)
Control de calidad de discos de sensibilidad
Enterococcus faecalis ATCC 29212

Control de niveles de timina y timidina del agar Mueller Hinton


(sulfonamidas, TRimetropin/sulfametoxazol
Control de discos de alta carga de aminoglucsidos (gentamicina de 120ug y
estreptomicina de 300 ug)
Seleccin de los discos de
sensibilidad antibitica
Criterios de seleccin:

Eficacia clnica documentada


Representatividad de una familia de antibiticos
Disponibilidad de criterios tcnicos fiables para la
determinacin in vitro de su eficacia clnica
Estabilidad de la molcula en los discos de
sensibilidad
Presencia en el mercado nacional
Importancia para la vigilancia de la resistencia
bacteriana
Seleccin de los discos de
sensibilidad antibitica
Los antibiticos han sido distribuidos para este efecto en
dos grupos:
Grupo 1: Antibiticos de base indispensable para orientar
el tratamiento de las diferentes infecciones, cuya
inclusin en el antibiograma y reporte de los mismos es
de carcter OBLIGATORIO

Grupo 2: Antibiticos complementarios cuya inclusin en


el antibiograma y reporte es de carcter OPCIONAL,
depende de los esquemas de antibioterapia vigentes en
cada hospital y de la epidemiologa local de la resistencia
bacteriana
Antibiograma para Staphylococcus spp
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL
ANTIBIOGRAMA
Grupo I: Grupo II:
Penicilina Cloramfenicol.

Oxacilina Rifampicina.

Eritromicina Tetraciclina.

Clindamicina Teicoplanina

Vancomicina Nitrofurantona(1)

Ciprofloxacina Norfloxacina(1)

Cotrimoxazol

Gentamicina (1) Disco utilizado exclusivamente


en cepas provenientes de
infecciones de las vas urinarias
Antibiograma para Enterococcus spp.
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL
ANTIBIOGRAMA
Grupo I: Grupo II:
Ampicilina Teicoplanina

Gentamicina (disco con contenido Rifampicina


de 120 mg) Cloramfenicol
Estreptomicina (disco con Tetraciclina
contenido de 300 mg) Eritromicina
Vancomicina
Nitrofurantona(1)

Norfloxacina(1)

Ciprofloxacina(1)

Levofloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente


en cepas provenientes de
infecciones de las vas urinarias
Antibiograma para Pseudomonas aeruginosa
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL
ANTIBIOGRAMA
Grupo I: Grupo II:
Ceftazidima Aztreonam

Imipenem y/o Meropenem Cefoperazona/sulbactam

Gentamicina Cefepime

Amikacina Norfloxacina(1)

Ciprofloxacina Ofloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente


en cepas provenientes de
infecciones de las vas urinarias
Resistencias Naturales
Los Estafilococos son resistentes a cido Nalidxico, cido
Pipemdico y Aztreonam
Staphylococcus saprophyticus es resistente a Fosfomicina y
Novobiocina
Staphylococcus cohnii y Staphylococcus xylosus son resistentes
a Novobiocina y a Lincomicina
Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina, Ampicilina,
Amoxicilina, cefalosporinas de primeray segunda generacin,
Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina,
Cloramfenicol, cidoNalidxico y cido Pipemdico.
Enterococos son resistentes a oxacilina, cefalosporinas,
Clindamicina, y Cotrimoxazol. Los enterococos presentan una
resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos, lo cual no
suprime la sinergia con los betalactmicos, por tanto deben
utilizarse discos con mayores concentraciones de antibitico
que las habituales buscando detectar una resistencia de alto
nivel que si elimina el efecto sinrgico.
CMO INTERPRETAR LOS RESULTADOS
Cmo Medir Zonas de inhibicin Inusuales

Zona con colonias internas


Doble zona de inhibicin

Zona afelpada
Zona con brotes
Como interpretar colonias dentro de las zonas
METODO DEL EPSILON TEST E-test

Consiste en tiras de plstico no poroso de 6 cm de largo


por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente
predefinido de antimicrobiano equivamente a 15
diluciones
El protocolo para preparar el inculo es el mismo que
para difusin en disco
Tras la incubacin de las placas se puede observar una
zona de inhibicin elipsoidal y simtrica
Se puede determinar mediante lectura directa la
concentracin inhibitoria minima (CIM) la cual ser
obtenido en el punto en el que el extremo de inhibicin
intersecciona con la tira
METODO DEL EPSILON TEST E-test
METODO DEL EPSILON TEST E-test
METODO DE DILUCIN
Se basa en la determinacin del crecimiento del
microorganismo en presencia de
concentraciones crecientes del antimicrobiano,
que se encuentra diluido en el medio (caldo o
agar)
Determina la Concentracin Mnima inhibitoria
CMI y posteriormente la concentracin mnima
bactericida CMB
Se utiliza para evaluar la sensibilidad de
bacterias de crecimiento exigente y no exigente
Mtodo de dilucin en caldo
Tubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Dilucin final 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 con


del antibiotico trol
ug/ ml
Caldo Mueller
Hinton ml
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Solucin de
antibitico de
1
trabajo ml
Inculo 1/100
Mc Farland ml
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Volumen final
ml
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Mtodo de dilucin en caldo
El antibitico de prueba se diluye en forma seriada en un rango
entre 128 ug/mm a 0.5 ug/ ml

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 control

MIC
Mtodo de microdilucin en caldo
antibiticos

128

Concentracin 64
de antibitico
32

MIC (Ug/ml) 16

1
Mtodo de dilucin en agar
Tubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Dilucin final 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 control


del antibiotico
ug/ ml
Agua destilada
estril ml
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Solucin de
antibitico de
1
trabajo ml
Medio de 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19
cultivo fundido
MH 45C
Volumen final 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
ml
Prueba de concentracin bactericida
mnima (MBC)
MBC MIC
128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 control
1
1 2 3 4 5

2 3

4 5
Prueba de combinaciones antibiticas
Ensayo del tablero
Difusin en discos
Deteccin de mecanismos de resistencia

Deteccin de BLEE (betalactamasas de espectro extendido)


Algunas enterobacterias productoras de estas enzimas pueden
presentar halos de inhibicin lo suficientemente grandes como
para ser clasificadas errneamente como sensibles a
cefalosporinas de tercera generacin y al Aztreonam

Dimetros crticos de tamizaje para la deteccin de BLEE

Antibiotico Halo de inhibicin


Aztreonam 30 ug 27 mm
Ceftazidima 30 ug 22 mm
Cefotaxima 30 ug 27 mm
Ceftriaxona 30 ug 25 mm
Deteccin de mecanismos de
resistencia
Test confirmatorio de la presencia de batalactamasas de
espectro extendido segn el Comit de Antibiograma de la
sociedad Francesa de Microbiologa

Si una imagen de sinergia


aparece entre el disco
Amoxicilina/ac. Clavulnico y
los discos de Ceftazidima y/o
Aztreonam y/o Cefotaxima
y/o Ceftriaxona, se considera
el test como positivo
Deteccin de mecanismos de
resistencia
Test confirmatorio de la presencia de batalactamasas de
espectro extendido segn el NCCLS - USA
Si los discos de
ceftazidima/ac.Clavulnico y
cefotaxima/acido clavulnico
presentan zonas de
inhibicin superiores 5 mm a
aquellos producidos por los
discos de Ceftazidima y
Ceftriaxona,
respectivamante, se
considera el test como
positivo
Deteccin de mecanismos de resistencia

Deteccin de MRSA
Se utiliza un disco de
Oxacilina de 1 ug o
un disco de Cefoxitina
de 30 ug.

Antibitico Disco Halo de inhibicin en mm comentario


R I R
Oxacilina Cefoxitina 30 ug 19 20 Para S. aureus
Oxacilina 1 ug 10 11-12 13
Oxacilina Cefoxitina 30 ug 24 25 Para estfilococo
Oxacilina 1 ug 17 18 coagulasa neg.
Deteccin de mecanismos de
resistencia
Deteccin de mecanismo MLS
Los aislamientos resistentes a macrlidos de Staphylococcus
aureus y Staphylococcus spp. coagulasa negativo pueden
tener resistencia inducida a clindamicina o podran ser solo
resistente a macrlidos.
Deteccin de mecanismos de
resistencia
Deteccin de Amp C
Los gneros Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia,
Morganella, Providencia stuarti y P. rettgeri son productores
de Amp C, la cul se sintetiza en presencia de antibiticos
beta-lactmicos

30 mm

IPM CAZ