Cromatografa de gases/lquidos

Iza Fernanda Prez Ramrez

Cromatografa de gases/espectrmetro de masas
Fundamentos bsicos
Introduccin
La cromatografa es un mtodo que permite la separacin,
aislamiento e identificacin de componentes presentes en una
mezcla compleja.

La primera separacin cromatogrfica es

atribuda al botnico Mikhael Tsvet, quien utiliz
una columna con carbonato sdico para la
separacin de pigmentos (1901).
Clasificacin de mtodos cromatogrficos

Cromatografa

Gas Lquido
Fase mvil (adsorcin) (particin)

Fase Slido Lquido Slido Lquido

estacionaria (GSC) (GLC) (LSC) (LLS)
Clasificacin de mtodos cromatogrficos
Cromatografa

Fase normal
(GC)

Fase reversa
(LC)

No polar Polar
Cromatografa gaseosa-slida (GSC)

Fuente de gas

Sistema de inyeccin

Columna cromatogrfica

Sistema de deteccin
Sistema para recoleccin
de datos e interpretacin
Cromatografa gaseosa-slida (GSC)
Consiste en el acarreo de una muestra a travs de la fase
estacionaria (columna) por la fase mvil (gas).

Los componentes de la muestra

interactan con las fases y son
eluidos dependiendo de sus
propiedades fisicoqumicas, lo que
conlleva a diferentes velocidades de
migracin.
Gas acarreador
El gas acarreador debe ser anhidro, libre de oxgeno e inerte.

Helio e hidrgeno son los gases ms utilizados, sin embargo la

seleccin del gas depende del rendimiento deseado y el tipo de
detector.
Gas acarreador

Hidrgeno/Helio

Nitrgeno
Inyector
El puerto de inyeccin permite la introduccin
de la muestra directamente en la columna.
Existen dos mtodos de inyeccin de la
muestra: split/splitless.
Se utilizan temperaturas elevadas de
inyeccin (~240 C) para la vaporizacin
instantnea de la muestra.
La muestra vaporizada se mezcla con el gas
acarreador para su transporte en la columna.
Horno
Programacin isotrmica.
La temperatura es constante durante toda
la separacin, y la temperatura ptima es
alrededor del punto medio del rango de
ebullicin de la muestra.

Programacin de temperaturas.
La temperatura es incrementada de
manera continua o en pasos con respecto
a la progresin de la separacin.
Columnas
Los principales tipos de columna son: empacadas y capilares.

FSWC: fused-silica wall-coated; WCOT: wall-coated open tubular; SCOT: support-coated open tubular
Columnas
Consideraciones para la seleccin de la columna:

Tipo de analito

Caractersticas de la columna

Espesor

Dimetro interno

Longitud

Recubrimiento (afinidad y polaridad)

Sistemas de deteccin
Es un equipo localizado al final de la columna que provee una
medicin cuantitativa de los componentes de la mezcla que han
sido eluidos con el gas acarreador.

El detector cuenta con un sensor y

un digitalizador, los cuales en
conjunto sirven como transductores
para la conversin de cambios de
la propiedad fsica detectada en
una seal elctrica que es
registrada como un cromatograma.
Tipos de sistemas de deteccin
Detector Muestras Sensibilidad

Espectrmetro de masas Universal 0,25 100 pg

Ionizacin de flama Hidrocarburos 1 pg/s

Conductividad trmica Universal 500 pg/ml

Captura de electrones Hidrocarburos halogenados 5 fg/s

Emisin atmica Elementos 1 pg

Vapores y compuestos
Fotoionizacin 0.002 0.2 ppm
gaseosos
Tipos de sistemas de deteccin
Detector de ionizacin de llama (FID)
Los detectores de ionizacin (FID, ECD, PID) interactan con los
solutos eludos de la columna del GC para producir una corriente
que vara en proporcin de la cantidad de soluto presente.

El FID es sensible a moleculas con se ionizadas en una flama de

hidrgeno-aire, incluyendo la mayora de compuestos que
contienen carbonos.

Los iones formados en el detector son forzados hacia un

electrodo por un potencial elctrico, produciedo una corriente en
el orden de picoamperes (10-12 A), la cual es convertida en
voltaje, filtrada y amplificada.
Detector de ionizacin de llama (FID)
Detector de ionizacin de llama (FID)
El gas acarreador de la columna entra al fondo del detector,
donde es mezclado con gas de combustin (hidrgeno) en el
rea de bajo del "jet de flama.

Se combina con aire y se quema justo sobre la punta del jet.

Se aplica un voltaje de polarizacin negativo entre la punta del

jet y el electrodo colector, por lo tanto los electrones formados
son acelerados a travs de la punta del jet y el colector por un
campo elctrico.
Detector de ionizacin de llama (FID)
Detector de captura de electrones (ECD)
Su funcionamiento se basa en la emisin de una partcula b
(electrn) por parte de tomos como el Nquel 63 o el trtio (3H).

El ECD es un detector muy selectivo y sensible a la presencia de

molculas con grupos electronegativos como halgenos y grupo
nitro.

Su principal aplicacin es para el anlisis de algunos insecticidas

o bifenilos policlorados (PCBs) en muestras medioambientales,
los cuales estn en concentraciones muy bajas (ppm y ppb).
Detector de captura de electrones (ECD)
El gas acarreador que sale de la columna del GC pasa a travs
de dos electrodos.

Uno de los electrodos (cmara catdica) tiene en su superficie un

radioistopo emisor de partculas b, electrones de alta energa.

Los electrones bombardean al gas acarreador resultando en la

formacin de un plasma de iones positivos, radicales y electrones
trmicos (< 0.1 ms).

La aplicacin de voltaje negativo la cmara catdica permite

colectar los electrones trmicos en el colector de electrones
situado ms adelante en la corriente de gas.
Detector de captura de electrones (ECD)
Cuando solo hay gas acarreador presente, se mide una corriente
de lnea base.

Al tener compuestos que pueden absorber electrones, stos

reaccionaran con los electrones trmicos y formarn iones
negativos pesados.

Los iones negativos pesados tienen mayor inercia que los

electrones, por lo que sern neutralizados rpidamente por los
iones positivos presentes en el plasma, lo que disminuir la
corriente elctrica.
Detector de captura de electrones (ECD)
El ECD es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las
molculas que contienen grupos funcionales tales como
halgenos, perxidos, quinonas y grupos nitro; en cambio, no es
sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e
hidrocarburos.

Su intervalo de respuesta lineal se limita a uno o dos rdenes de

magnitud
Sistema cromatogrfico
Mdulos

Bomba cuaternaria

Inyeccin

Columna

Detectores

Fotodiodos
Dispersin de luz
Espectrmetro de
masas
Sistema de separacin UPLC

Ventajas
Velocidad
Resolucin
Sensibilidad
Baja dispersin: Columnas de
pequeo dimetro empaquetadas
con partculas < 2 m y distribucin
de fase mvil a 15 000 psi
Bomba cuaternaria
Fase mvil Seleccin de disolventes
Fase mvil Seleccin de disolventes
Fase mvil Variacin de pH del disolvente

Amortigua el pH de la columna Interacciones ms fuertes con los compuestos Menor coleo

Columna
Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios
C1 -CH3, metil Para compuestos muy retenidos en C18.
C2 -CH2-CH3, etil Anlisis ms rpidos que con C18. Anlisis de
C4 -(CH2)-CH3, butil pptidos y proteinas.
C6 -(CH2)-CH3, hexil
C8 -(CH2)7-CH3, octil Empleo general.
C18 -(CH2)17-CH3, Empleo general. Es la fase ms empleada.
octadecil (ODS)
FENIL -(CH2)3-Phe, Compuestos moderadamente polares.
fenilpropil Retencin similar a C8, pero ms selectiva
para compuestos aromticos
CIANO -(CH2)3-CN, Solventes polares y no polares. Selectividad
cianopropil hacia dobles y triples enlaces.
NITRO -(CH2)3-Phe-NO2, Separacin de compuestos con dobles
nitrofenilpropil enlaces y aromticos.
Columna
Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios
AMINO -(CH2)3-NH2, Selectividad a CN, NO2 y silicagel. Anlisis
aminopropil de carbohidratos. Intercambio aninico dbil.
DIOL -(CH2)3-O- Menos polar que silicagel, pero ms que CN.
CH(OH)- Menos estable
CH2(OH)
N(CH3)2 -(CH2)3-N(CH3)2 Intercambiador aninico dbil (WAX)
-SO3Na -(CH2)3-Phe-SO3- Intercambiador catinico fuerte (SCX)
+
-N(CH3)3 -(CH2)3-Phe- Intercambiador aninico fuerte (SAX)
NMe3+
-COONa -COO- Intercambiador catinico dbil (WCX)
Detector de matriz de fotodiodos (PDA)
Fotodiodos

Se hacen incidir haces de luz en una columna de boro, los

cuales son reflejados por el recubrimiento de teflnAF
Detector de matriz de fotodiodos (PDA)

La red est formada de 512

fotodiodos, los cuales actan como
condensadores para el
almacenamiento de una cantidad fija
de carga
El detector mide la cantidad de luz
que incide sobre la red de fotodiodos
y determina la absorbancia de la
muestra en la cubeta de flujo
Detector de dispersin de luz evaporativa
(ELS)
El efluente es mezclado con gas acarreador
(nitrgeno), y es nebulizado a baja temperatura
para la formacin de pequeas gotas

En la regin de desolvatacin, la fase mvil es

evaporada, dejando las partculas del analito
secas (en dado caso de que sean menos
voltiles que la fase mvil)

Un haz de luz incide sobre el analito, lo que

hace que la luz se disperse y se concentre en el
tubo fotomultiplicador, el cual mide su
intensidad (voltaje) que es proporcional a la
masa del analito
Espectrometra de masas
La muestra es bombardeada por electrones que ionizan la
molcula, lo que produce que sta pierda un electrn debido a la
repulsin electrosttica. La energa residual permite la
fragmentacin de los iones.
Espectrometra de masas
Los iones son conducidos al analizador de masas, en donde son
separados de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z).

Finalmente, los iones separados son medidos, y los resultados

son graficados en un grfico.
Espectro de masas
El espectro de masas es un diagrama de barras verticales, en el
que cada barra representa un ion con un valor m/z especfico, y
la longitud de la barra indica la abundancia relativa del ion.

La mayora de los iones presentan

slo una carga, por lo que el valor
de m/z representa la masa.
Espectro de masas
Pico base:
Representa el ion mas intenso, al cual se le asigna una
abundancia de 100.
Ion molecular:
Es el ion con mayor masa (m/z).
Fragmentos de iones:
Son fragmentos del ion molecular y presentan bajos valores de
masa (m/z).
Espectro de masas
Ejemplo: Se presentan los espectros de masas de tres
compuestos gaseosos simples, los cuales presentan tamaos
similares.

44 amu 44 amu 42 amu

Ion molecular
Espectro de masas
La molcula de dixido de carbono est compuesta por tres
tomos, por lo que su espectro de masas es muy sencillo.

Ion molecular = Pico base

Fragmentos: CO (m/z=28) y O (m/z=16)

Espectro de masas

Ion molecular (m/z=44) no es el ms abundante del espectro.

Pico base (m/z=29: cation etilo) posiblemente debido a que su

estructura permite mayor dispersin de la carga.
Espectro de masas
Patrones de fragmentacin:
La naturaleza de los iones fragmentados provee informacin
sobre la estructura de la molecular.
Si el ion molecular tiene un tiempo de vida media menor de
algunos microsegundos, ste no sobrevivir lo suficiente para
ser observado, por lo que las condiciones de ionizacin deben
ser ajustadas.
Sin el ion molecular como referencia, se incrementa la
dificultad en la interpretacin del espectro de masas.
Espectro de masas
Patrones de fragmentacin:
La complejidad de los patrones de fragmentacin ha originado que
el espectro de masas sea utilizado como huellas digitales para la
identificacin de un compuesto.
Iones fragmentados:
170: ion molecular 29: catin de etilo
85: catin de hexilo 15: catin de metilo
71: catin de pentilo 55, 41 & 27: carbocationes
57: catin de butilo de alquenilos
43: catin de propilo
Espectrometra de masas
- Ionizacin por electrospray (ESI)
El eluyente cromatogrfico es dirigido a un capilar de
acero inoxidable que carga un voltaje de 2000-4000 V

Conforme el lquido sale del capilar a presin

atmosfrica se convierte en un spray fino (aerosoliza),
liberando los iones que fluyen al espectrmetro de
masas gracias a la atraccin electrosttica y el vaco

El cono o gas de contracorriente ayuda a la

desolvatacin de las gotas lquidas
Espectrometra de masas
- Triple cuadrupolo o tandem (ms/ms)

El cuadrupolo acta como un separador o

filtro de masas

Los iones exhiben oscilaciones de

amplitud constante de acuerdo a su masa,
lo que permite su separacin para ser
recolectadas en el analizador

Triple cuadrupolo

Permite separar iones de una m/z especfica

Fragmentar un ion precursor (padre) en iones productos (hijas)

Espectrometra de masas
- Triple cuadrupolo o tandem (ms/ms)
Anlisis MS/MS
Espectrometra de masas
- Triple cuadrupolo o tandem (ms/ms)
Anlisis MS/MS
Espectrometra de masas
Tipos de anlisis MS

MS1 - Scan

MS1 SIR (Selected ion recording)

MS2 - Daughter

MS2 MRM (Multiple reaction monitoring)

 MS2 (SCAN)

Perfil lipidmico SCAN (m/z: 300-1200)

 MS2 (SCAN)

Perfil lipidmico SCAN (m/z: 300-1200)

 MRM (TIC)

Perfil de flavonoides Anlisis de MRM

 MRM (TIC)

Perfil de flavonoides Anlisis de MRM

 MRM (289<205)

MRM (TIC)

Perfil de flavonoides Anlisis de MRM

 SIR

Perfil metabolmico Anlisis SIR

 SIR

Perfil metabolmico Anlisis SIR

 SIR

Perfil metabolmico Anlisis SIR

Tiempo de vuelo (TOF)
Mtodo de espectrometra de masas en el que se mide la
relacin m/z de un ion a travs de una medicin de tiempo.
Los iones son acelerados por un campo elctrico, lo que
conlleva a que un ion tendr la misma energa cintica que otro
ion con la misma carga.
La velocidad de cada ion depender de la relacin m/z:
Iones ms pesados Velocidades bajas
Iones ms ligeros Velocidades altas
Tiempo de vuelo tndem (TOF-TOF)
El tiempo de vuelo tndem es un mtodo espectromtrico en
donde se manejan dos TOF consecutivamente.
El primer TOF incluye un tiempo de vuelo. Aisla los iones
precursores o padres seleccionados utilizando un filtro de
velocidad.
El segundo TOF-MS incluye un acelerador, tubo de vuelo, espejo
de iones y detector de iones. Analiza los fragmentos de iones.
Cromatgrafo de gases/espectrmetro de masas
Preparacin e
inyeccin de muestras

Origen de la muestra

Analito(s) de inters
Cromatgrafo de gases/espectrmetro de masas
Mtodo de separacin

Analito(s) de inters

Seleccin de la columna

Eficiencia/especificidad

del mtodo
Cromatgrafo de gases/espectrmetro de masas
Interpretacin de datos

Analito(s) de inters

Base de datos

Resultados de inters
Identificacin de metabolitos
Preparacin e inyeccin de muestras

Seleccin y optimizacin del mtodo cromatogrfico

Interpretacin de datos
Preparacin de muestras
Extraccin de analitos de inters

Con disolventes (metanol, cloroformo, acetona, acetonitrilo, hexano)

Derivatizacin de analitos

Sililacin

Acilacin

Alquilacin
Extraccin de analitos de inters

Adicionar 1 Sonicar Filtrar

20 mg
mL de
muestra (30 min) (45 m)
disolvente

Disolventes (metanol, cloroformo, acetona, acetonitrilo, hexano)

Derivatizacin de analitos de inters
Derivatizacin
Proceso que consiste en modificar qumicamente un compuesto para
producir un derivado con nuevas propiedades que faciliten o permitan su
anlisis.

Caractersticas del proceso

Procesamiento mnimo

Rendimiento mximo de la reaccin y alta reproducibilidad

Correspondencia entre el nmero inicial de analitos y derivados

El origen qumico de los productos es predecible

Derivatizacin de analitos de inters
Acilacin
Conversin de compuestos con hidrgenos activos en steres, tioesteroles y aminas

Aquilacin
Reemplazo de un hidrgeno activo con un grupo alquilo o arilo

Sililacin
Reemplazo de un hidrgeno activo con un grupo alquilsililo
Derivatizacin de analitos de inters
Sililacin: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
El BSTFA produce compuestos con grupos trimetilsilil, formando derivados
voltiles y trmicamente estables para su anlisis por GC-MSD.

El TMCS incrementa la capacidad de donacin de sililos del BSTFA

Derivatizacin de analitos de inters
Ventajas
Transformacin de compuestos no voltiles en derivados voltiles.
Conversin de compuestos no detectables en productos apropiados por minimizacin
del lmite de deteccin.

Anlisis de compuestos reactivos que presentan interaccin con la fase estacionaria de

la columna.

Incremento de la especificidad de la fragmentacin del ion molecular para la estimacin

de estructuras.

Desventajas
Incremento del peso molecular de los compuestos
Derivatizacin de analitos de inters
Sililacin: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
El BSTFA es susceptible a hidrlisis, por lo que se recomienda la eliminacin
de agua de las muestras previo a la derivatizacin.

Debido a la reactividad del BSTFA con hidrgenos activos, se debe evitar el

uso de disolventes con hidrgenos lbiles en el proceso de derivatizacin.
Derivatizacin de analitos de inters

Evaporar Adicionar 50
Re suspender
muestra con L de BSTFA- Inyectar
muestra
N2 gaseoso TMCS

BSTFA-TMCS: Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano (1%)

Seleccin y optimizacin del mtodo
Seleccin de un mtodo base

Seleccin de columnas

Polaridad de los analitos de inters

Optimizacin del mtodo cromatogrfico

Restriccin de compuestos de inters

Eficiencia y mejora del perfil cromatogrfico

Mtodo base

Inyector Temperatura de inyeccin: 250 C

Modo de inyeccin: Splitless

Volumen de inyeccin: 2 L
Mtodo base
Columna Columna: HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m)

Flujo del gas acarreador: Helio, 1 mL/min (isocrtico)

Programa de temperatura (gradiente):

Temperatura Velocidad Stand-by
100 C --- 1 min
220 C 6 C/min 1.23 min
290 C 10 C/min ---
310 C 40 C/min 7.5 min
Mtodo base

Detector Temperatura del detector: 230 C (fuente de iones) y

150 C (quadrupolo)

Energa de fuente de iones: 70 eV

Rango de masas: 50-700 m/z

Seleccin y optimizacin del mtodo
Optimizacin del mtodo cromatogrfico

Defectos en los cromatogramas y/o espectros de masas

Mejora de la separacin cromatogrfica

Interpretacin de datos
Identificacin de compuestos de inters

Estndares externos o interpretacin de espectros de masas

Extraccin de resultados

Identificacin de compuestos por tiempo de retencin

Extraccin de espectros de masas, ion base, ion molecular, fragmentos de iones

Cuantificacin por porcentaje de rea relativa

Extraccin de reas de los compuestos de inters

Identificacin y cuantificacin de capsaicinoides
Preparacin e inyeccin de muestras

Optimizacin del mtodo cromatogrfico

Interpretacin de datos
Sntomas en los cromatogramas
No se observan picos:
La concentracin o el volumen de la muestra es insuficiente.
No hay analitos en la muestra.
La jeringa no est correctamente instalada.
La entrada del GC est sucia.
La rosca de la entrada de la columna est suelta.

Los picos presentan mesetas:

Escala incorrecta en el cromatograma (TIC).
El volumen de inyeccin es muy grande.
El voltaje del EM es muy alto.
Sntomas en los cromatogramas
Los picos presentan coleo (al final):
El volumen de inyeccin es muy grande.
La temperatura inicial del horno es muy alta.
El flujo de gas es insuficiente.
La temperatura de la interfase o de la fuente de iones es muy baja.

Los picos estn coleo (al inicio):

El volumen de inyeccin es muy grande.
La temperatura inicial del horno es muy baja.
El flujo de gas es insuficiente.
La presin del inyector es muy alta.
Sntomas en los cromatogramas
Los picos presentan divisiones:
La tcnica de inyeccin es inadecuada.
El volumen de inyeccin es muy grande.

La lnea base se est elevando:

Sangrado o contaminacin de la columna.

La lnea base est elevada:

Sangrado o contaminacin de la columna
El voltaje del EM es muy alto.
Sntomas en los cromatogramas
La lnea base se est cayendo:
Hay agua o aire residual debido a un venteo reciente.
Sangrado de la columna o de la septa.
El tiempo de inyeccin es muy prolongado.

La lnea base se est ondeando:

El flujo de gas es insuficiente.
Hay fugas de gas intermitente en la entrada del GC.
El regulador del flujo o de la presin no est funcionando
adecuadamente
Sntomas en los cromatogramas
Los tiempos de retencin se estn acortando:
Se ha cortado la columna.
La temperatura inicial del horno se ha incrementado.
La columna se est deteriorando.

Los tiempos de retencin se estn alargando:

El flujo de la columna se ha disminuido.
La temperatura inicial del horno se ha disminuido.
Hay fugas de gas intermitentes en la entrada del GC.
Sntomas en los cromatogramas
Baja sensibilidad:
Las condiciones del tuning son incorrectas.
Las temperaturas (horno, interfase, fuente de iones) son inadecuadas.
La concentracin de la muestra o la relacin del split es muy baja.
La entrada del GC est sucia.
Presin excesiva en el MSD.
La fuente de iones est sucia.
Hay fuga de gas en el GC.
El EM est funcionando incorrectamente.
La polaridad del filtro de masas es incorrecta.
Sntomas en los cromatogramas
Baja repetibilidad:
La jeringa de inyeccin est sucia.
La entrada del GC est sucia.
Hay fuga de gas en la entrada del GC.
El volumen de inyeccin es muy alto.
Las conexiones de la columna estn sueltas.
Hay variaciones en la presin, temperatura y flujo de gas.
La fuente de iones est sucia.
Sntomas en los espectros de masas
No hay picos:
Los cables de la fuente de iones no estn conectados.
Las conexiones del detector son inadecuadas.
Hay fallas en las conexiones electrnicas..

Elevadas abundancias a 18, 28, 32 y 44 o 14 y 16 (m/z):

Hay aire o agua residual debido a un venteo reciente.
Hay fuga de aire.
Ganancia
Control de la ganancia

Esun potencimetro que determina el nivel en

voltaje de entrada de la seal

Le
dice al amplificador el rango de voltaje con en el
que va a trabajar
Control de la ganancia
Lo que hace una ganancia es establecer un parmetro para
que la unidad principal est sincronizado con la potencia
que puede desarrollar el amplificador

Ajustar correctamente la ganancia= poner al amplificador a

trabajar en su mxima potencia
Control de la ganancia

Una ganancia bien ajustada implicar un sistema

con un nivel de ruido bajo, y una lgica visual detrs
de la lectura de volumen de tu unidad principal
La ganancia es un parmetro del instrumento,
no del aparato
Entre ms ganancia
se tenga, mayor ser
el ruido
Regulador de ganancia en un GC-MS
Regulador de ganancia en un GC-MS
Regulador de ganancia en un GC-MS
Ganancia fija en nuevos equipos Mxima
eficiencia
Terminologa
Absorcin:
La retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que
tiene sta a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la misma.

Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto.

Adsorcin:
Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un slido,
quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta
retencin superficial puede ser fsica o qumica.

C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar.

C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar.

101
Terminologa
Disolvente : Cualquier fase mvil.

Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.

Fase estacionaria:
Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica
durante la cromatografa y que retiene algn componente de la
muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o
un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte.

102
Terminologa
Fase mvil:
Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se usa como
portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna cromatogrfica y
la fase estacionaria.

Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.

Soporte:
El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase
estacionaria lquida en su sitio.

Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

103
Parmetros cromatograficos

Pico de aire

Lnea base

Altura de pico (h)

Anchura del pico w (4)

rea del pico

104
Terminologa
Cromatograma:
Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la
concentracin del soluto y se registra su seal en funcin del tiempo
(o del volumen de fase mvil aadido) se obtiene una serie de picos
que representan un grafico denominado cromatograma.

Grafico til para el anlisis cualitativo y/o cuantitativo.

La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra
Las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la
105

cantidad de cada componente.

Terminologa
Tiempo de retencin:

Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de

concentracin del analito alcanza el detector;

Es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna;

Es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico,

Se representa con el smbolo tR.

106
Volumen y tiempo de retencin

Volumen de retencin, VR: Volumen de fase mvil

requerida para eluir un soluto de la columna

Tiempo de retencin, tR: Tiempo requerido para cada

componente para recorrer toda la columna.

107
Volumen y tiempo de retencin
VR = tR flujo

tRb
tRa
seal

A B

108
Terminologa
Tiempo muerto tM:

Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance

el detector;

Es el tiempo de migracin de la especie no retenida;

Es el tiempo necesario para que, por termino medio, una

molcula de la fase mvil pase a travs de la columna

109
Terminologa

110
Terminologa
La velocidad lineal promedio de migracin del soluto es:

111
Terminologa
Velocidad lineal promedio u del movimiento de las molculas de la fase mvil
es:

112
Plato terico
Sistema ESTATICO en equilibrio

Cada especie presenta un equilibrio entre la fase mvil y la fase

estacionaria

A fase movil A fase estacionaria

Terminologa
Constante de distribucin:
Los equilibrios de distribucin suponen la transferencia de una analito entre las fases.

A mvil A estacionaria
La constante de equilibrio para este proceso se denomina:
Constante de distribucin
Razn de distribucin o
Coeficiente de distribucin
Mide la distribucin del analito entre la fase estacionaria y la fase mvil.

CS es la concentracin molar del soluto en la fase estacionaria (mol/L)

CM es la concentracin molar en la fase mvil (mol/L)

114
Coeficiente de reparto

Concentrac ion del soluto en la fase estacionar ia

K
Concentrac ion del soluto en la fase movil

K es independiente de la concentracin. Puede

afectarse por factores como la temperatura.

Cuando K se incrementa el soluto tarda ms tiempo

en pasar a travs del sistema

115
Factores que influyen en la separacin
Valores de K suficientemente diferentes.

Tener el suficiente # de equilibrios

Eficiencia en la columna:
tR mas cortos
Picos mas angostos

116
Coeficiente de reparto
L
v tR t0 nsolutoM
f
u L tR nsolutoT
t0

f es la fraccin de tiempo que el soluto pasa en la fase

mvil.
Puesto que las fases estacionaria y mvil, tienen
volmenes conocidos; Ve, Vm. A partir de esto, se puede
calcular el coeficiente de particin.
Coeficiente de reparto

C M VM
v u
C M VM C E VE
Dividiendo entre: CMVM

1

v u
1 C E VE

C M VM
118
Coeficiente de reparto
Como:

K
C solutoE
1

C solutoM v u
V
1 K E

VM

VM u
K 1
VE v
Coeficiente de reparto
VM u
K 1
VE v

Cuando se incrementa:
VE: Se incrementa la retencin.
VM: Disminuye la retencin.
Coeficiente de reparto
VM u
K 1
VE v
VE y VM, pueden alterarse cambiando el dimetro y la
longitud de la columna

u y v, puede modificarse al variar el flujo.

Factor de capacidad
La razn de la cantidad de soluto en la fase estacionaria y la
cantidad en la fase mvil.

Es caracterstico de un compuesto especifico en una composicin

de fase mvil a una temperatura y en un tipo de columna

122
Factor de capacidad

nE
k
nM

123
Terminologa
Factor de retencin o factor de capacidad:
Describe la velocidad de migracin de los solutos en la columna. Para una especie A,
el factor de capacidad kA se define como:

kA es el coeficiente de distribucin de la especie A,

VS es el volumen de la fase estacionaria y
VM es el volumen de la fase mvil.

124
Terminologa
Factor de retencin o factor de capacidad:
Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relacin con el tiempo
transcurrido en f. mvil.

Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, dividido entre el
tiempo de elucin de una banda no retenida (k=0)

La relacin establece cuantos volmenes muertos (o tm) se necesitan para alcanzar a

Vol. de retencin (o tr)

Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elucin es tan rpida que es
difcil determinar con exactitud los tiempos de retencin.
Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retencin son
excesivamente largos.

125
Factor de capacidad

k K
VE 1
VM v u
1 k


1

v u
1 K VE

VM

L L
u v
t0 tR
Factor de capacidad
L L 1

tR t 0 1 k

tR t0
k
t0
Magnitudes corregidas
Tiempo de retencin ajustado
t B
t A
tB
t
tA k R
t0

t0

0.0
tiempo
1 k' 3 128
Factor de selectividad
Medida de separacin relativa entre dos picos

Medida de la interaccin relativa de los solutos

con la fase estacionaria

129
Terminologa
Factor de selectividad:
El factor de selectividad de una columna para dos especies:

KB es el coef. de distribucin para la especie mas retenida

KA es el coeficiente para la menos retenida

Depende de la naturaleza de la fase estacionaria y mvil, y

La temperatura de operacin de la columna

130
Factor de selectividad
Se puede evaluar la selectividad en base a los
tiempos de retencin para cada soluto.

t RA t 0

k
t0 t RA t 0 t RA
A

K t RB t 0

B t RB t 0 t
RB

t0

1 2
Terminologa
Resolucin cromatogrfica:
La resolucin cromatogrfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar
dos analitos.

WA y WB son la anchura de los picos A y B.

Si R > 1.5 la separacin de los componentes es completa
La resolucin puede mejorarse alargando la columna, aumentando as el nmero de platos. Una
consecuencia negativa es el incremento del tiempo requerido para la separacin.

132
Resolucin
134
Terminologa
Eficiencia en cromatografa
La eficiencia se define en base a dos trminos
1 La altura del plato H
2 El nmero de platos N.

La eficacia de la columna a mayor nmero de platos, y

A menor altura de plato.
Las eficacias en trminos de nmero de platos varan de cientos a miles, y
Las alturas de plato de unas pocas dcimas a milsima de centmetro.

135
Nmero de plato terico
En extraccin con disolvente, un plato es representado por
cada equilibrio (extraccin).
En una destilacin fraccionada, un plato es representado por
cada destilacin.
En una columna cromatografca se puede aplicar el concepto
de plato terico (cada evento de separacin realizado).
Se puede estimar el nmero de platos tericos en la columna
basado en los tiempos de retencin y ancho de las seales
de cada compuesto.

136
Altura equivalente a un plato terico
Longitud de columna en que se lleva a cabo una
separacin.

L
H
N

137
Equilibrios

138
Terminologa
Nmero de platos N:

139
Terminologa
Las bandas cromatogrficas tienen una forma gaussiana,
Definir eficacia de una columna en trminos de varianza por unidad de longitud.

La curva es gaussiana, y la ubicacin de L -1 y L +1 se indica mediante lneas

verticales discontinuas.

140
Nmero de plato terico
Mtodo de las tangentes.

2
tR
N 16
W tan

141
Nmero de plato terico

142
Resolucin

144
145
Teora de la separacin

Como se lleva a cabo la separacin.

Como son las seales analticas.

146
 Factor de Asimetra
AF = 1 Pico simtrico
AF = b / a AF > 1 Pico coleado
AF < 1 Pico cabeceado

a b
10% 147
Factor de asimetra

Cs

CM
148
Asimetra de la banda
Si k es mayor a concentraciones mas bajas de soluto
La zona de baja concentracin del pico eluye mas lentamente.
Por lo tanto la seal del pico ser coleada
Combinacin equivocada de muestra y empaque de columna

El tipo inverso de asimetra se conoce como cabeceado

k` es mayor a concentraciones mas altas de soluto.
Solucin :
Disminuir el tamao de la muestra hasta que las bandas sean simtricas y tR
constantes.

149
Resolucin
Ecuacin fundamental de la resolucin
1
1 1 k L 2

R
4 1 k H

1 1 k
N 2
1
R
4 1 k

Donde k es un promedio entre k 2 y k 1

si k 2 k 1, entonces k = k2 150
Eficiencia de la columna
Empleo de columnas mas largas incrementamos N

Trabajar con condiciones optimas de flujo y temp.

k incrementa disminuyendo la temperatura

Alfa se aumenta:
Sustituyendo la fase estacionaria.

151
Variables cinticas
Variable Smbol Unidade

o s

Vel. Lineal de la fase mvil u cm/s

Coeficiente de difusin en la fase mvil Dm cm2/s

Coeficiente de difusin en la fase estacionaria Ds cm2/s

Factor de retencin k -

Dimetro de la partcula de relleno dp cm

152

Espesor del recubrimiento liquido en la fase df cm

Variables cinticas
Efecto del caudal de la fase mvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

H = mm

153

v = cm/s
Variables cinticas
Efecto del caudal de la fase mvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

Velocidades lineales menores en lquidos.

Las separaciones cromatograficas en gases son en menor tiempo

Las alturas de plato son por lo menos un orden de magnitud menor en

lquidos.

Columnas
En lquidos 25 a 50 cm (cada de presin)
En gases 50 m o ms
154
Teora Cintica
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer:
Dinmica de la separacin.

Ecuacin de van Deemter

H A Cu A CS CM u
B B
u u
155
Difusin de Eddy
Termino del camino libre

Difusin en remolino

Difusin parasita

B
H A Cu
u 156
Difusin parsita
A 2 d p
H = cm
N

: Constante del empaque dada por la calidad del relleno

dp: diametro de la partcula

157
Difusin longitudinal

B
H A Cu
u 158
Difusin longitudinal
H =N
cm : Cte. del empaque, factor de obstruccin.
Columnas rellenas = 0.6
Columnas capilares = 1

DM: Difusin de soluto en la f. mvil

Velocidad de migracin por gradiente

B/v
v

B 2DM 159
Resistencia a la transferencia de masa

B
H A Cu
u

160
Transferencia de masa
HN
= cm df: Grosor de la fase estacionaria.

DE: Coef. de difusin del soluto en la fase estacionaria

Cv

A
B/v
v
8k d 2f
C
1 k DE
2

161
Efecto global
N
H = cm
B
H A Cu
u
Global

H ptimo Cu

A
B/u

v
v = cm/s
Vel. lineal
ptima
162
Teora Cintica
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y
Sjenitzer: Dinmica de la separacin

2DM 8k d 2

H 2 d p u
f

1 k DE
2
u

163
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Cualitativo
Parmetros de retencin
Detectores selectivos
EM, FTIR, RMN, UV

Cuantitativo
Altura de pico
rea de pico

Buena resolucin
Respuesta en el rango de linealidad del detector 164
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Anlisis cuantitativo

Altura de pico o rea de pico?

El rea debe utilizarse para picos con colas pronunciadas

Ambos son imprecisos, con un volumen de inyeccin
irreproducible.
La altura de pico puede usarse si el ancho del pico de los
compuestos es el mismo para estndares y muestra.

165
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de reas

Normalizacin de reas con factores de respuesta

Estndar externo

Estndar interno

166
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de rea o altura de pico
Limitacin: todos los componentes deben eluir.

A1
x% 100
A1 A2 A3 An

167
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de rea con factor de respuesta

conc
F
area

F1 A1
x% 100
F1 A1 F2 A2 F3 A3 Fn An
168