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BIOLOGIA DEL

AGROBACTERIUM
Kingdom :Bacteria
Phylum :Proteobacteria
Class :Alproteobacthaperia
Order :Rhizobiales
Family :Rhizobiaceae
Genus :Agrobacterium
Species :A. tumefaciens
EUCARIOTA PROCARIOTA

1) el DNA se encuentra unido


a proteinas
2) sus genes estan 1) el DNA se encuentra
interrumpidos por desnudo
secuencias que no se 2) los genes no tienen in-
expresan y que se pierden al trones
transcribirse el DNA en 3) los genes tienen sus propias
mRNA (intrones) senales promotoras de la
3) los genes tienen senales transcripcion.
promotoras particulares de 4) los mecanismos para la
la trans- cripcion de DNA a activacion y la desactivacion
mRNA y los mecanismos de de genes son mucho mas
regulacion de la expresion simples
de los genes son complejos.
Son paquetes de genes coherentes Los genes en cada uno cumplen
funciones interrelacionadas

Recibe a la proteina
represora Codifican enzimas

Codifica proteina
represora

Lugar que reconoce


la ARN Polimerasa
Inducibles Catabolismo

Se activa en respuesta
a un agente inductor
OPERONES

Reprimibles Anabolismo

Se inactiva en respuesta
a un agente correpresor
A. tumefaciens es una bacteria del suelo,
gramnegativa, que infecta a las plantas en lugares
en los que existen heridas y produce la enfermedad
de las agallas de la corona. Afecta a una amplia
gama de especies vegetales, fundamentalmente
dicotiledneas.
Agrobacterium presenta tres importantes
caracteristicas.
La primera es que, ademas de ser capaz de
transferir un fragmento de DNA a las celulas
vegetales, es capaz de integrarlo en el genoma de
estas.
La segunda es que los genes de ese DNA, aun
procediendo de una bacteria, son reconocidos por la
celula vegetal y se expresan.
La tercera es que es la unica bacteria que posee los
genes codificadores de las enzimas necesarias para
metabolizar las opinas. Estos genes tambien se
encuentran en el plasmido Ti.
Uno de esos plasmidos es el responsable de la
induccion de tumores, y por eso recibe el nombre
de plasmido Ti (del ingles, tumor-inducing).
Durante el proceso de infeccion, Agrobacterium
transfiere una porcion bien definida de ese
plasmido, llamada T-DNA (DNA de transferencia),
al genoma de las celulas vegetales. La integracion y
la expresion de ciertos genes del T-DNA
(oncogenes) hace que las celulas transformadas se
dividan y proliferen sin control, y se formen los
tumores.
El ori permite que el plasmido Ti sea mantenido de forma estable en A tumefaciens.

Existen tres elementos geneticos necesarios para la transferencia del T-DNA a la planta, (regiones
presentes en los plasmidos de Agrobacterium) :

Bordes flanqueantes del T-DNA:


A la izquierda y derecha del T-DNA existen dos direct repeats de unos 24-25pb que flanquean y
definen el T-DNA. Estos bordes son secuencias en cis necesarias para la transferencia y normalmente
todo el DNA contenido entre los mismos es transferido a la planta
Genes vir.
Genes de virulencia o region vir codificada por el plasmido Ti en una region de 35 kb localizada fuera
del T-DNA, (existen 25 genes vir reunidos en 7 operones)
Genes codificados por el cromosoma bacteriano.
Estos genes son necesarios para la union de la bacteria a la celula vegetal danada.
GENop
Responsable de la sintesis de opinas.
GENES onc
Son genes del plasmido T-DNA responsables de la codificacion de enzimas que intervienen en la
sintesis de hormonas vegetales y por lo menos un aenzima clave en la biosintesis de la opina.
Las opinas son aminoacidos particulares con es-
queletos carbonados, que unicamente son
aprovechados por la bacteria como fuente vital
de carbono y nitrogeno. Las cepas de
Agrobacterium se clasifican en distintos grupos
en funcion del tipo de opina que producen. Con
mucho, los mas numerosos son los grupos
octopina y nopalina.

De este modo, Agrobacterium actua como un


parasito molecular de las celulas vegetales
infectadas, haciendolas tumorales y
convirtiendolas en fabricas de opinas. Estas se
vierten al suelo circundante y sirven de alimento
a las agrobacterias que se encuentran en el.
1. Reconocimiento Agrobacterium-celula
vegetal. Depende de los genes
cromosomicos de virulencia chv, que estan
implicados tanto en el movimiento
quimiotactico bacteriano como en la union de
la bacteria a receptores especificos de la
celula vegetal.
2. El gen virA se expresa de forma
constitutiva en la bacteria y codifica una
proteina asociada a la membrana interna de
Agrobacterium. Las celulas vegetales liberan
compues- tos fenolicos, fundamentalmente
acetosiringona, en los lugares donde existen
heridas. En estas condiciones de induccion
apropiadas, la proteina VirA activa el gen
virG.
3. La union de la proteina VirG a ciertas
regiones de los demas genes vir induce la
activacion de estos genes.
4. Las proteinas VirD1 y VirD2 actuan de forma conjunta
como una endonucleasa, realizando cortes especificos en
el borde derecho del T-DNA y dando lugar a la liberacion
de una cadena simple de T-DNA. Al extremo 5 de dicha
cadena permanece unida VirD2. Posteriormente, tambien
se une VirE2. Ambas proteinas, al unirse a la cadena de
T-DNA, forman el llamado complejo T y actuan
protegiendo el DNA de la accion de nucleasas durante el
proceso de transferencia a la celula vegetal. Las
nucleasas son enzimas que degradan los acidos
nucleicos.
5. El transporte intercelular del complejo T se produce a
traves de un canal entre Agrobacterium y la celula vegetal
formado por proteinas codificadas por los genes virB.
6. La entrada del complejo T al nucleo de la celula vegetal
requiere el reconocimiento de senales especificas de lo-
calizacion nuclear (SLN) presentes en las proteinas VirD2
y VirE2, unidas a la cadena de T-DNA, lo que permitira el
paso del complejo T a traves de los poros nucleares.
7. El complejo T se desensambla por la accion de virF de
las proteinas nucleares del huesped, o de ambos. Se
produce la integracion del T-DNA en el genoma de la
celula vegetal.
Transformacion de celulas vegetales mediante disparo de
microproyectiles a alta velocidad. Los microproyectiles
son particulas de oro o tungsteno que tienen aglomerado
el DNA foraneo y que se disponen sobre un soporte.
Cuando se dispara el canon, los proyectiles y su soporte
se aceleran, el soporte queda retenido en una red
metalica, los proyectiles siguen viajando a alta velocidad y
penetran en el tejido vegetal, integrandose en el genoma
de las celulas.
Diagrama de flujo de los procedimientos para el mtodo
Agrobacterium-medlatod de transformacin de Musa. (1)
planta madre con progenie "sucker" de la cual se asla
una punta de brote (cv Grand Nein). (2) Micro-
propagacin clonal. (3) Microdiseccin de puntas de
brotes micropropagadas en meristemos apicales
bisectados (3 a 5 mm de altura) y rodajas de cormos (2 a
3 mm de espesor) de brotes in vitro. (4) Bombardeo de
micropartculas: heridas en los tejidos. (5) Inoculacin con
Agrobacterium plus acetosyringone, seguido por cocultivo
durante tres das en medio de micropropagacin con
acetosiringona, (6) Regeneracin de brotes y seleccin de
transformantes en medio de micropropagacin selectiva.
(7) Regeneracin de raz y seleccin de transformante en
medio de micropropagacin selectivo. (8) Procedimientos
de seleccin. (9) Microdiseccin de puntas de brotes
transformadas potencialmente quimricas. (10)
Regeneracin de brotes y translorman (seleccin en
medio de micropropagacion selectiva) (11) Regeneracin
de raz y seleccin transformante en medio de
micropropagacin selectiva. (12) Determinar la
uniformidad de presencia y expresin del transgn.
Revista Nature 1995
Para crear plantas transgenicas resistentes al
glifosato, se combina el gen de la EPSP sintasa
de una bacteria con un promotor, como por
ejemplo, el promotor del virus del mosaico de la
coliflor. Este gen fusionado se inserta luego en
un vector plasmidico Ti y el vector
recombinante se inserta en celulas huesped de
R. radiobacter. La infeccion mediante R.
Radiobacter de celulas de plantas cultivadas
transfiere el gen fusionado de la EPSP sintasa
a un cromosoma de la celula de planta. Las
celulas que adquieren el gen son capaces de
sintetizar grandes cantidades de EPSP sintasa,
lo que las hace resistentes al herbicida
glifosato. Las celulas resistentes se
seleccionan mediante crecimiento en un medio
que contiene el herbicida. Las plantas
regeneradas a partir de esas celulas son
resistentes al herbicida.