Molgramostim (GM-CSF No

Glicosilado)
Maximiliano Mondragn| Enrique Pineda| Anlisis de Medicamentos
Qu es el Molgramostin?
Es un factor estimulante de colonias de
granulocitos y macrfagos (GM-CSF),
constituido por 127 aminocidos y no
glicosilado.
Datos

Compuesto por: 127 aminocidos

Frmula : C639H1007N171O196S8
Peso Molecular: 14 477 Da
 Descripcin

Polvo blanco,
Libre de
Liofilizado partculas
extraas

Contiene como
mnimo 2.0 mg Solucin
de Protena/mL
Solucin incolora Libre de
o ligeramente partculas
amarilla extraas
 Produccin

Aprobacin:

Protenas del hospedero

ADN residual
Ensayos de Identidad:
Ensayo
A. Potencia (MPB 0340)
B. Enfoque Isoelctrico
C. Impurezas con Masa
molecular diferente a la del
molgramostim (MGA 0311).
D. Mapeo de Pptidos (MGA
0241: CLAR)
E. Secuencia N-terminal
Endotoxinas bacterianas (MGA
0316)
Protenas relacionadas (MGA
0241: CLAR)
Especificacin
act. biolgica esperada: 10 x 106
UI/mg de protena
Barra principal de muestra
corresponde con la barra
principal de la referencia. PI no
ms de 0.2 unidades de dif.
La posicin de las bandas es
similar: s-ref FEUM y muestra
evaluada.
Corresponde con el
cromatograma de referencia
16 primeros Aa N-terminal
debern ser Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-
Pro-Ser -Pro-Scr-Thr -GIn-Pro-
Trp-Glu-His-Val
No ms de 5 UI/mg
Mximo para cada impureza:
1.5%
Mximo, impurezas totales (e 5-
30) : 4%
Resultado
Actividad biolgica esperada
Las barras corresponden
PI:
Muestra: 5.0
Referencia 5.1
Posicin de bandas similares
tanto s-ref FEUM como en
muestra evaluada.
Corresponde con el
cromatograma de referencia
Los 16 primeros Aa N terminal
Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Pro-Ser -
Pro-Scr-Thr -G In-Pro-Trp-Glu-
His-Val corresponden.
3 UI/mg
Por impureza: 1.01%
Para impurezas totales: 3%
Ensayo de Identidad

Alternativa 1 Alternativa 2

A A

B B

C C

D D

- E
A. Potencia

MPB 0340. BIOANLISIS EN CLULAS TF-1 DE FACTOR ESTIMULADOR

DE COLONlAS DE GRANULOCITOS Y MACROFAGOS

Fundamento:

Se basa en la estimulacin de la proliferaci6n de celulas TF-I, dnde la sal de

tetrazolio reacciona por la enzima deshidrogenasa mitocondrial para obtener
formazn, el cual se mide espectrofotomtricamente. Comparacin 50 % vs 50
%.
B. Enfoque Isolctrico
C. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-SDS
 D. Mapeo de pptidos

Identificacin de una protena, as como el producto final de varios procesos

que proporcionan una comprensin completa de la protena que se analiza.

Divisin selectiva de enlaces

Aislamiento y Purificacin
peptdicos

Separacin cromatogrfica de
Anlisis Validado
pptidos
 E. Secuencia N-terminal
Hay que hacer una degradacin de Edman en un equipo secuenciador de fase
solida.
Cargar 1mmol de material a probar en el cartucho del secuenciador
Correr 16 ciclos

El procedimiento de separacin se calibra usando:

Mezcla de a.a-PTH
Una mezcla del primer ciclo de secuenciacin en blanco
MGA 316 Determinacin de Endotoxinas
Bacterianas
Endotoxinas/ Lipopoliscaridos
La tcnica de cuantificacin ocupa el lisado de Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus
Metodo A: Formacion de un gel
Metodo B: Turbidimetrico y cromogenico

Material y reactivos
Control Estndar de Endotoxina (CEE) = preparacin de endotoxina de E. coli caracterizada
Lisado de amebocitos (LAL)
*El material empleado debe estar libre de endotoxinas (material de vidrio y termorresistente ciclos
de 250C x 30min)
Impureza molecular diferente al Molgramostim
Analizar por electroforesis gel poliacrilamida-SDS (14% acrilamida, espesor 0,75mm), en el ensayo se realiza en
condiciones reductoras y no reductoras.
Solucin amortiguadora muestra A: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra R
Solucin amortiguadora muestra B: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra para condiciones reductoras R
Muestra 1 control muestra + H20 C= 1,0mg/ml + sol. Amortiguadora concentrada de muestra R
Muestra 2 control 2% Diluir 20uL de la muestra 1 con 980 uL de sol. Amortiguadora de muestra A
Muestra 3 control 1% 0,2 mL de la muestra 2 + 0,2mL de sol. Amortiguadora A
Muestra 4 control 0,5% **
Muestra 5 control 0,25% **
Muestra 6 control 0,1 **
Muestra 7 control 0,05 **
Muestra 8 control 0,025 **
Muestra 9 Preparar igual que la muestra 1, pero con sol. Amortiguadora condiciones reductoras
Muestra 10-16 Preparar igual que muestra 2-8 pero con solucin amortiguadora de muestra B
Impureza molecular diferente al Molgramostim
Prep. Ref 1 Diluir ref. molgramostim en agua C= 0,02 mg/ml + Sol. Amortiguadora concentrada muestra R
Prep, Ref 2 ** + Sol. Amortiguadora concentrada para condiciones reductoras de muestra R
Prep. Ref 3 Marcadores de peso molecular 14,400- 94,000 Da
*Calentar las muestras a ebullicin x 3min
Colocar 50uL de muestra en condiciones reductoras o no, en geles separados segn corresponda
Sumergir el gel toda la noche en una mezcla 10:40:50 COOH, H20, MetOh.
Transferir el gel a una sol de 100g/L de glutaraldehido 30min.
Remplazar el glutaraldehido por agua x 20 min.
Transferir el gel a una mezcla 0,75 g/L NaOH, 14 g/L NH4OH y 8 g/L AgNo3.
Colocar en un agitador oscuridad x 5min, Lavar cada 30 seg con agua
Agitar el gel es una mezcla 0,05 g/Lde acido ctrico, formaldehido 0,05% (v/v), MetOh + H20 0,005% (v/v)
Impureza molecular diferente al Molgramostim
*Las bandas de protenas se harn visibles en esta etapa
Comprar la intensidad de cada una de las bandas al Molgramostim, el nivel de impurezas se
estima con la dilucin