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Validacin de Tcnicas

Espectroscpicas

Q.F. Soraya Sandoval Riquelme


Subdepto. Laboratorios del Ambiente
Consideraciones
Los tipos de ensayo a considerar
sern los siguientes:
a) Mtodos de identificacin
b) Determinacin cuantitativa de
un componente
c) Determinacin cualitativa de un
componente
X

ROBUSTEZ
X X

SELECTIVIDAD
Validacin de Mtodo

BIAS
X
LINEALIDAD
X
L. CUANTIFICACION
X
X X
X X
L. DETERMINACION
L. DETECCION
X
% RECUPERACION

X X
REPRODUCIBILIDAD
REPETIBILIDAD
CURVA CALIBRACION

X
X
X
Sensibilidad
Parmetro

Presicin
Exactitud
Parmetros de validacin
Analisis Exactitud Repetibilidad Reproducibilidad L.D L.C Lineali-dad Selectividad Robustez

Cualitativo
X X X

Cuantitativo
alta X X X X X X
concentracin

Cuantitativo
baja X X X X X X X
concentracin
Mtodo Espectrofotometrico
Caractersticas esenciales para que sea
cuantitativo son:
1. Que el mtodo sea selectivo al analito que se
desea analizar.
2. Que est libre de interferencias que afecten el
resultado analtico que las interferencias se
puedan controlar.
3. Que tenga alta precisin y exactitud.
4. Que tenga una alta sensibilidad y
5. Que el lmite de deteccin corresponda a una
concentracin baja.
Sensibilidad

Linealidad
Rango de Trabajo
Curva de Calibracin
Curva de Trabajo
Sensibilidad Analtica/Instrumental
Limites
Sensibilidad/Linealidad
Capacidad del mtodo analtico para obtener resultados
directamente proporcionales a la concentracin o
cantidad del analito en un rango definido.
La pendiente de la recta de calibracin debe ser
constante en todo el intervalo de aplicacin del
procedimiento de medida.
El lmite inferior de dicho intervalo vendr determinado
por el valor obtenido para el lmite de cuantificacin del
mtodo. El lmite superior del intervalo estar
condicionado, en general, por la prdida de linealidad en
la curva de calibracin.
Sensibilidad / Rango Trabajo
Para obtener el intervalo ptimo de concentraciones primero se
construye la CURVA DE RINGBOM, que consiste en construir una
grfica de absortancia (100- %T) vs log Concentracin. Los
datos se obtienen:
1) Preparar serie de soluciones patrn del
analito (cubrir una variacin de por lo
menos 2 rdenes de magnitud de
Analito: Mtodo:
Concentracin)
Curva de Ringbom
2) Medir transmitancias correspondientes a . 120

3) En la mayora se obtiene una curva en 100

Absortancia (100-%T)
forma de S. 80
4) La parte lineal de esta grfica permite 60
obtener el intervalo de Conc. ptimo o el
intervalo que presentara una relacin lineal 40

entre absorbancia y concentracin. 20

5) En esta grfica, los cruces de la parte recta 0


(la intermedia), con la parte baja y con la 0.01 0.1 1 10 100
Concentracin, mg K/L
parte alta, pueden servir para determinar un
valor para los lmites de deteccin mnimo y
mximo, respectivamente.
Sensibilidad / Curva de Calibracin
La curva de calibracin se Analito: Mtodo:
construye de la recta de la Curva de Calibracin
curva de Rigbom, es decir, en el
1.0
0.9
rango que tenga una relacin 0.8
0.7
lineal. Se grafica as:

Absorbancia
0.6

1) Absorbancia ( eje ordenas, 0.5


0.4
Y ) vs Concentracin ( eje 0.3

abcisas, X ).
0.2
0.1

2) Se debe obtener un 0.0


0 5 10 15 20 25
coeficiente de correlacin Concentracin, mg K/L

estadsticamente significativo.
3) La grfica de la recta de
calibracin debe incluir los
puntos experimentales.
Sensibilidad / Curva de Trabajo
Corresponde a La recta Analito: Mtodo:

ajustada de la curva de 0.30


Curva de trabajo

Calibracin. y = 0.1192x
0.25 R2 = 0.9994
Se deben seleccionar los
0.20
puntos (patrones o

Absorbancia
estndares), con los 0.15

cuales se trabajara para 0.10

la determinacin del 0.05

analito. 0.00
Incluye el valor de 0 0 0.5 1 1.5
Concentracin, mg K/L
2 2.5

mg/L , 0.000 UA. O sea,


el intercepto por el cero.
Curva de Calibracin/ Curva de Trabajo

Intercepto: Es el estimador que se relaciona


con la presencia de interferencias o errores
sistemticos. El intervalo de confianza del
intercepto debe incluir al cero para cumplir
con el requisito de proporcionalidad.
(Como se exige para el cumplimiento de la
ley de Lambert-Beer en los mtodos
espectrofotomtricos).
Sensibilidad / Rango Trabajo
Rango de trabajo:
1. Patrones de trabajo deben abarcar
todo el Rango del Mtodo: (Valor
mximo-Limite inferior) .
2. Se recomienda mnimo 3 patrones y
ptimo 8 patrones. Mejor 5 patrones.
3. Para establecer la Linealidad de
Curva: Se recomienda trabajar en
rangos de concentraciones de 1:2, o
1:3:6.
Sensibilidad /Sensibilidad Analitica

Es la pendiente de la recta (conocida


tambin como coeficiente de
regresin) de calibracin que se
obtiene cuando el resultado (o seal)
de la medida o una funcin de la
misma se representa frente a la
cantidad o concentracin del analito.
Indica la sensibilidad de calibracin o
del mtodo y se expresa en unidades
de respuesta sobre unidades de
Sensibilidad /Sensibilidad Analitica
Se considera que a mayor pendiente, mayor sensibilidad
y que mientras ms pequeo sea el coeficiente de
variacin de la pendiente mayor ser la linealidad
(coeficientes de variacin de la pendiente mayores que
el 5,0 % indican falta de linealidad).
Ejercicio 1 (Ejemplo) : concentracin
mg/L
Absorbancia (UA)

Determinar.
0 0,0001

1. Curva de Ringbom 0,25 0,0316


0,5 0,0625
2. Curva de calibracin 1 0,1247

3. Curva de trabajo 1,5 0,1853

2 0,2431

2,5 0,3028

3 0,367

3,5 0,431

4 0,488

6 0,731

8 0,825

10 0,9500

12 0,9980
Curva de Calibracin /Sensibilidad Instrumental
Sensibilidad Instrumental (S):
Se define como la razn de cambio en la
respuesta del instrumento al cambiar el
correspondiente estmulo: concentracin,
temperatura, masa, etc, por ejemplo:
S = dG/dC (donde G = Seal de salida, C = Concentracin del analito)

Puede expresarse en trminos de concentracin


como:S = 0.0044/ mcal relacin cuyas unidades
corresponden a concentracin.
Curva de Calibracin /Sensibilidad Instrumental
El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la
mnima diferencia medible con precisin ( D T = 1.0% T ) en
instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una
absorcin de 1% corresponde a 0.0044 unidades de
absorbancia, aplicando:
A = log [100 / (100-%absorcin) ] = log [100 / ( 100-1)] = 0.00436
Una respuesta no lineal en la grfica de A vs C indica un
cambio en el valor de la sensibilidad en funcin de la
concentracin. Conforme la concentracin del analito se
aproxima a cero, la seal desaparece dentro del ruido y se
rebasa el lmite de deteccin
Conc. Estandar (ug/mL)x0.0044/Abs. mdida
Cant. Absoluta (g)x0,0044/Abs. mdida
Curva de Calibracin /Sensibilidad Instrumental

Una solucin de 20 ng/L de arsnico lee


una absorbancia de 2.467 UA. calcule la
sensibilidad instrumental:
Sensibilidad instrumental = 0,00002x0,0044/2,467
Curva de Calibracin / Limites

Lmite de deteccin o concentracin


mnima detectable:
Medicin tipo 1: Preparar 10 soluciones del
blanco de procedimiento, se leen las
absorbancias respectivas y se calcula la
desviacin estandar de las lecturas. En caso
de leer en absorbacia transformar de acuerdo a
curva de trabajo a unidades de concentracin el
valor de L.C. Obtenido.
L.D.: 3 SDbco
Curva de Calibracin / Limites
Lmite de deteccin o concentracin mnima
detectable:
Medicin tipo 2:
1. Preparar 20 soluciones del blanco de procedimiento.
2. Preparar 10 patrones de baja conc. ( menor al ultimo
punto de curva) para 2 puntos de concentracin bajo la
curva de trabajo.
3. leer las concentraciones alternativamente: blanco1,
patron1, blanco2, patrn 2, blanco 3, patrn 1, blanco 4,
patrn 2, blanco 5, etc...respectivas.
4. Calcular el valor corregido para lectura de cada patrn:
Valor corregido= Patrn 1- [( blanco 1+blanco 2)/2]
Curva de Calibracin / Limites
Lmite de deteccin o concentracin mnima
detectable:
Medicin tipo 2:
5. Calcule la media y SD de las lecturas directas y
corregidas para cada patrn .
6. Calcule la razn entre F1= Patrn 1 ledo/Patrn 2 ledo y
entre F2= Patrn 1 corregido /Patrn 2 corregido.
7. Calcule: L.D. Ledo = Concentracin patrn 1x 2SD patrn1
leido/patrn1 ledo y L.D. Ledo = Concentracin patrn2x 2SD
patrn2 ledo/patrn2 ledo
8. El L.D. del mtodo se obtiene del promedio de L.D ledo para
patrn 1 y L.D ledo para patrn 2 y se acepta si las razones F
son equivalentes.
Curva de Calibracin / Limites
Lectura 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Blanco -0,21 -0,09 0,25 -0,14 0,69 0,19 -0,04 -0,09 1,2 -0,26
5 ng/ml 5,78 6,97 6,38 4,91 5,31 6,4 5,55 5,51 5,59 5,4
Blanco 0,34 -0,29 -0,25 -0,47 -0,16 -0,9 0,55 0,87 0,05 -0,09
10 ng/ml 10,82 11,4 11,63 10,42 10,64 11,65 11,29 10,7 10,81 11,14
-0,91

Lectura Corregida 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5 ng/ml 5,715 7,16 6,38 5,215 5,045 6,755 5,295 5,12 4,965 5,575
10 ng/ml 10,695 11,42 11,825 10,31 10,625 12,12 11,06 9,665 10,915 11,64

Patrn n Promedi SD Promedi SD Facto Factor L.D. Promedi


o leido o corregido r corregido Leida o
leido corregido leido L.D.

5 ng/L
solucion 1

10 ng/L
solucin 2

Se acepta L.D. si F leido = F corregido


Curva de Calibracin / Limites

Lmite de determinacin:
Medicin tipo 1: Preparar diez soluciones del blanco de
procedimiento, se leen las absorbancias o concentraciones
respectivas y se calcula la desviacin estndar de las
lecturas. En caso de leer en absorbacia transformar de
acuerdo a curva de trabajo a unidades de concentracin el
valor de L.C. Obtenido.

L.d.: 6 SDbco
Curva de Calibracin / Limites

Lmite de Cuantificacin:

Medicin tipo 1: Preparar diez soluciones del blanco de


procedimiento, se leen las absorbancias o concentraciones
respectivas y se calcula la desviacin estndar de las
lecturas. En caso de leer en absorbancia transformar de
acuerdo a curva de trabajo a unidades de concentracin el
valor de L.C. Obtenido.
L.C.: 10 SDbco
Curva de Calibracin / Limites
Concentracin Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Lectura 4 Lectura 5 Lectura 6 Lectura 7 Lectura 8 Lectura 9 lectura 10
Blanco 0 mg/L 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Blanco UA 0,002 0,002 0,003 0,003 0,003 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002

Lectura promedio SD L.D. L.d L.C


blanco

mg/L

UA

Y= 2.803X + 0.0017 m=2.803 Y en UA X en mg/L


Curva de Calibracin / Limites

Lmite de deteccin mximo: Se define como la


mxima concentracin de un analito que se puede
analizar.
En caso de soluciones altamente concentradas, para
mtodos espectrofotomtricos, toda la luz es
atrapada por el analito, equivalente al ajuste del 0 %
de transmitancia.
En dichas situaciones el detector por sobre este
limite no diferencia dos soluciones de
concentraciones altas.
El lmite de deteccin mximo, se puede obtener de
la parte superior de la curva de Ringbom.
Exactitud

Selectividad
Recuperacin
BIAS/ Sesgo
Incertidumbre
Exactitud/ Definicin
Qu tan exacto es mi mtodo?
Qu diferencia existe entre mi resultado y el valor real?
Puedo conocer el Valor real de mi analito en una muestra?

Para poder realizar un clculo de la exactitud del mtodo
a validar es necesario disponer de un valor de referencia.

Mediante las pruebas realizadas se comparan los valores


y se determina si entre el valor medio de los mismos y el
valor de referencia no existen diferencias que se
consideren inaceptables.

Exactitud/ Selectividad
Se desea determinar la capacidad de un mtodo analtico para
medir exacta y especficamente el analito sin interferencias de
impurezas, productos de degradacin o excipientes que pueden
estar presentes en la muestra.
Selectividad Especifidad
Selectividad: Capacidad de detectar simultnea o
separadamente sustancias qumicas diferentes presentes en una
misma muestra. Se expresa como el grado de inexactitud del
mtodo.Es especialmente importante en el caso de cuantificacin
de un analito con presencia de interferentes.
Especificidad: Capacidad de detectar el analito sin interferencias
de otro compuesto. En EAA es especifica la para cada Analito.

Se puede determinar comparando los resultados del anlisis de


muestras en presencia de interferentes con los resultados del
anlisis de las muestras sin interferentes o vs. un anlisis en el
cual se hayan realizado la atenuacin de interferentes de matriz.
Exactitud/ Selectividad
Realizar un barrido del analito de inters
determinar la Long. Onda mx. y min. de
trabajo.
Obtener el espectro molecular
Realizar espectro de analito en muestra
y estndar y comparar.
Realizar espectro de analito v/s un
similar.
Exactitud/ % de Recuperacin
Recuperacin: % de recuperacin de un analito que es
adicionado a una muestra. (adicin estndar).
Es decir se calcula el % de la fraccin del analito
fortificado que es medido.

Ejemplo:
Concentracin del patrn adicionado: 1 mL de patrn de cobre
de 100 mg/L a 100 mL de muestra de agua. Cual es la
concentracin del patrn aadido =Xa
Lectura muestra: (n=3) 2.53 mg/L = Xi
Lectura muestra + patrn adicionado (n=3) : 3.47 mg/L =Y
Calcule el % de recuperacin:

%Recuperacin: Y x Xi_x100
Xa
Exactitud/ BIAS/Sesgo
El sesgo es una expresin de la inexactitud del mtodo y representa
el error sistemtico total.

El Sesgo es la desviacin o diferencia de los resultados obtenidos.


Sesgo/BIAS: (Valor medido - Valor esperado)

La exactitud de un mtodo analtico indica que tan alejado se


encuentra el valor medido del valor verdadero o valor real.

Error absoluto: (Valor medido - Valor esperado) x 100

Error relativo: [(Valor medido - Valor esperado) / Valor esperado] x 100


Exactitud/ BIAS/Sesgo
Si Vm Ve (muy pequea diferencia) buena exactitud.

Si Vm >>Ve o Vm << Ve , se tiene una baja exactitud.

Medicin: Medir n rplicas de un patrn certificado o de


referencia, cuyas caractersticas sean muy similares a las de la
muestra, es decir que la matriz de anlisis sea lo mas parecida a la
muestra que se esta analizando. Se obtiene el valor medio de
concentracin del analito y se calcula el error relativo, tomando
como valor esperado el contenido del analito certificado en el patrn
de referencia.
Por lo que Vm en realidad es una media de los valores obtenidos de
las lecturas realizadas.
Exactitud/ BIAS/Sesgo
Se debe tener para este calculo un valor de referencia es decir
un material de referencia:

Calcule el sesgo de una muestra de sodio cuyo valor de


referencia es 0.50 mg/L y cuyas lecturas obtenidas fueron=
0.51, 0.50, 0.51, 0.52, 0.52, 0.52, 0.53, 0.53, 0.53, 0.53 mg/L.
Cmo es la exactitud del mtodo?
Exactitud/ Incertidumbre
Incertidumbre de la medida: Estimacin que
caracteriza el intervalo de valores en el que se
sita generalmente, con una probabilidad
determinada, el valor verdadero de la magnitud
medida.
La incertidumbre de la medida incluye, en
general, varios componentes. Algunos pueden
estimarse a partir de la distribucin estadstica de
los resultados de una serie de mediciones y
pueden caracterizarse por la desviacin tpica
muestral. La estimacin de otros componentes
solamente puede basarse en la experiencia o en
otras informaciones.
Precisin

Repetibilidad
Reproducibilidad
Robustez
Precisin/ Definicin
Es el grado de concordancia entre los
resultados obtenidos aplicando el
mtodo repetidas veces, bajo
condiciones determinadas.
La precisin slo depende de la
distribucin de errores aleatorios.
Precisin/ Repetibilidad (r)
Cualitativamente: Es el grado de concordancia entre
resultados sucesivos obtenidos con el mismo mtodo sobre
una materia idntica sometida al ensayo, en las mismas
condiciones (siempre el mismo operador, igual aparato, igual
laboratorio y en pequeos intervalos de tiempo).
Cuantitativamente: Es el valor por debajo del cual est
situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto
de la diferencia entre dos resultados individuales obtenidos
en las condiciones anteriormente expuestas.
Medicin: Realizar medicin de una muestra o patrn de
referencia en iguales condiciones:
= analista,cercania t,= mtodo ,=equipo.

Calcular la Media y SD.


Precisin/ Repetibilidad (r)
Muestra Control
0,4970
Valores expresados en mg/L
0,4990
0,5000 Calcule :
0,4910
0,4970
Promedio de lecturas:
0,4950 SD:
0,4920
0,4910 RSD%:
0,4900
0,4970
0,4949
Precisin/ Reproducibilidad (R)
Cualitativamente: Es el grado de concordancia entre dos
resultados individuales obtenidos con el mismo mtodo
sobre una materia idntica sometida al ensayo, pero en
condiciones diferentes (operadores distintos, aparatos
diferentes, distintos laboratorios y/o pocas diferentes).

Cuantitativamente: Es el valor por debajo del cual est


situado, con una probabilidad especificada, el valor
absoluto de la diferencia entre dos resultados individuales
obtenidos en las condiciones anteriormente expuestas.
Medicin: Realizar medicin de una muestra o patrn de referencia
cambiando 1 o ms factores (analista, t, mtodo, equipo, etc.).
Calcular la Media y SD.
Precisin/ Robustez
Es el grado de reproducibilidad de los resultados obtenidos
mediante la ejecucin del mtodo sobre una misma
muestra variando algunas condiciones operacionales
como, por ejemplo, diferentes laboratorios, reactivos,
analistas, equipos, temperaturas de ensayo, etctera.

Se determina como una funcin de las variables


seleccionadas en la ejecucin y los resultados se
comparan con los resultados del estudio de
reproducibilidad del mtodo para obtener una medida de la
tolerancia del mtodo analtico.

Tambin se puede estimar, el resultado ms real es el que


se obtiene en las pruebas interlaboratorios.
INFORME DEL PROCESO DE
VALIDACIN
El informe deber incluir al menos la siguiente
informacin:
Instrumental y recipientes adecuados para la toma
y conservacin de las muestras.
Descripcin completa del mtodo analtico.
Concentraciones ensayadas.
Valores obtenidos en los ensayos realizados.
Valores calculados para la precisin, sesgo, r y R
para cada concentracin.