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Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin


del DNA.

DNA
PCR
Muchas
moleculas
(molecule sencilla) amplificacin
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de DNA especficos hibridizan con la


cadena que tiene que ser copiada
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T A C
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T A C G T
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5 3
-T A C G T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Despues del primer periodo de sintesis de


DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?


Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2

Al mismo tiempo, la cadena original se copia


nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1

Ahora tenemos dos copias de la molcula original


Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusin Hibridizacin Extensin de 2do Ciclo


95C 50-60C La cadena 95C
75C 50 - 60C
75C
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en
el nmero de copias
Hay 7 componentes esenciales en
el proceso standard de PCR
ADN polimerasa termoestable
Oligonucleotidos iniciadores (primers)
Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
Cationes divalentes
ADN molde (Templado)
ADN polimerasas termoestables
Llevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del
templado.
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3, ej. Taq agrega una A al exremo 3,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)
La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu
Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis
Oligonucletidos iniciadores
(primers)
Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles,
1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
Oligonucletidos iniciadores
(primers)
Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del
proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(c) Evitar las secuencias repetidas
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3 5-NNNNNNNNTATA-3
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3 3-ATATNNNNNNNN-5

3 repetido
5 3 PCR
3 5

5 3
3 5

Dmero de primer
(c) Evitar las secuencias repetidas
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3 5-TATANNNNNNNN-3
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3 3-NNNNNNNNATAT-5

5 repetido
5 3 PCR
3 5

5 3
3 5

no hay extensin
(c) Evitar las secuencias repetidas
5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3 5-NNNNNNNNNNNGCA
5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3 3-CGT

Formacin de horquillas
5 PCR
3

5
3 5 3

Productos de PCR no deseados


Oligonucletidos iniciadores
(primers)
Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del
proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(d) Valores de Tm de no mas de 5C uno del otro
ADN molde (templado)
Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble
cadena)
ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej:
1 g de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de
bacteriano o 1 pg of plasmdico
Se puede amplificar a partir de una sola molcula
de ADN molde, pero las condiciones deben estar
muy optimizadas
El ciclo de PCR
Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos si G+C < 55%
Temperatura de hibridizacin (Annealing) debe ser calculada
o determinada empiricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no especfico = productos
incorrectos
Extensin -
a la temperatura ptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la
longitud deseada, los cuales a partir de all se tornan en el
producto principal
El ciclo de PCR
Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos si G+C < 55%
Temperatura de hibridizacin (Annealing) debe ser calculada o determinada empiricamente
para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no especfico = productos incorrectos
Extensin -
a la temperatura ptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a
partir de all se tornan en el producto principal
Nmero de ciclos -
- algunos componentes se tornan limitantes despues de 30
ciclos (si el nmero inicial = 105 molculas)
- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia
nica a partir de ADN genmico de mamfero DNA
Variantes de la PCR
Touchdown PCR
Colony PCR
Multiplex PCR
Hot start PCR
Nested PCR
Inverse PCR
Long PCR
Multiplex PCR
Describe una PCR enla cual hay presentes
multiples pares de primers (hasta 8) lo que
da una serie de productos. Los mismos
pueden verse como mltiples bandas en un
gel de agarosa
Multiplex PCR es frecuentemente usada en
diagnstico mdico
Ahorra templado, tiempo y gastos
Requiere una cuidadosa optimizacin
Nested PCR
A veces 1 ronda de PCR no da un producto nico
product a partir de un templado complejo,
apareciendo un chorreado
Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente
que los primeros
Realizar una segunda ronda de PCR usando el
producto de la primera (chorreado)
Rinde un producto nicoporque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridizacin para el segundo par de primers
Nested PCR
1era PCR

Chorreado de ADN

2da PCR

ADN especfico
Clonado con PCR: clonado T-A
A-3 T-3'
3-A 3'-T

Producto de PCR
Vector con cola-T
a partir de Taq

ligamiento

T-3'
3'-T
A
A

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor


que ligamiento con extremos romos
Mutagnesis por PCR
Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN
El mtodo de extensin solapada requiere 2
primers mutagnicos y otros 2
Amplifica un fragmento 5 y un fragmento
3 que se solapan. Ambos portan la
mutacin
Usa los productos en otra reaccin para
producir el ADN mutado de longitud
completa
Mutagenesis con PCR- extension solapada
Primer SP6 Primer mutagnico directo (forward)

Dos 1ras Primer T7


primer mutagnico inverso (reverse)
PCRs
separadas
X

remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

2da PCR

x
RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
Para amplificar copias de cDNA de RNA
Es especialmente til cuando solose dispone de pequeas
cantidades de RNA
Frecuentemente usada para amplificar genes especficos
(como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida
Requiere primer antisense y un DNA polimerasa
dependendinte de RNA
Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
Luego se usa un segundo primer (sense) para hacer el
duplex de cDNA por PCR
RT-PCR
mRNA AAAAAAAAAA-3 Primer Antisense:
(sense) TTTTTTTTTT-5 oligo(dT)o

Transcripcin reversa

GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3
TTTTTTTTTT-5
1ra cadena cDNA
GSP (antisense)

PCR usando
GSP+GSP1
GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1