Anda di halaman 1dari 46

Purifikasi dan Rekayasa Protein

Rahma Ayu Larasati


Pendahuluan
Protein berasal dari bahasa, Yunani, yaitu: protos yang
berarti yang paling utama.
Protein merupakan 50 - 70% berat kering sel
Protein dengan komposisi yang banyak ini memiliki
peran yang sangat penting pada fungsi biologis
organisme (misal: fungsi gerak, berkembang biak,
dan gradien).
Definisi
Protein merupakan senyawa
makromolekul yang tersusun
atas asam amino-asam amino
yang dihubungkan melalui
ikatan peptida. Senyawa ini
juga disebut sebagai
polipeptida.
Asam amino merupakan asam
organik yang bersifat amfoter
yang mengandung gugus amino
(NH2), gugus karboksil (COOH),
atom hidrogen dan gugus R
(rantai cabang).
Ikatan Peptida
Ikatan peptida : ikatan
antara -karboksil
(COOH) satu asam amino
dengan -amino (NH2)
dari asam amino lainnya.
Satu ikatan peptida
menghubungkan 2 asam
amino
SIFAT FISIK DAN KIMIA PROTEIN

Sifat Fisika
merupakan senyawa makromolekul dengan berat
molekul yang besar.
Sifat Kimiawi
Sangat reaktif karena memiliki sifat :
o Amphoter
o Mengikat ion
o Mengikat air
Sifat ini disebabkan protein dapat bermuatan negatif,
positif dan keduanya pada lingkungan pH tertentu
Amphoter
Protein mempunyai dua sifat yang berlawanan yaitu dapat bersifat asam atau basa, atau
dapat bereaksi dengan asam atau basa, atau dapat memberi dan menerima proton
secara bersamaan.
Sifat ini dipengaruhi pH lingkungan dimana protein tersebut berada.
pH < titik isoelektrik, protein akan cenderung bermuatan (+) (kationik)
pH > titik isoelektrik, protein cenderung bermuatan (-) (anionik).
pH = titik isoelektrik, protein memiliki muatan (+) dan (-), bersifat zwitter ion.

Catatan :
Zwitter ion = senyawa yang memiliki dua kutub yang berlawanan (dipolar ion)
Titik isoelektrik (isoelectric point, pl) = suatu nilai pH, dimana protein memiliki muatan
elektrik total sama dengan nol dalam suatu larutan
Lanjutan------Sifat Fisik & Kimia Protein

Kekuatan mengikat ion (binding of ion)

Tergantung pada pH lingkungan


pH > pl, protein/asam amino bersifat anionik (bersifat negatif, COO-),
sehingga akan mudah mengikat ion bermuatan (+) (cation).
pH < pl, protein/asam amino bersifat kationik (bersifat positif, NH3+),
sehingga akan mudah mengikat ion bermuatan (-) (anion).
campuran protein akan memiliki pl yang berbeda-beda, sehingga
campuran protein tersebut akan memiliki muatan yang bervariasi pula
dan dapat mengikat berbagai macam ion.
Kekuatan mengikat molekul air (hydration of protein)

Timbul karena adanya


Gugus nitrogen, baik yang ada pada N-terminal maupun N pada rantai peptida
Gugus karboksil (COOH, pada C-terminal)
Gugus karbonil (CO, dalam rantai peptida); ergantung pada pH lingkungan
pH > pl dan pH < pl, protein memiliki kemampuan mengikat air yang lebih besar
dibandingkan pH = pl
Tergantung pada konsentrasi protein, pH, suhu dan adanya senyawa lain.
Semakin tinggi konsentrasi protein akan semakin banyak mengikat air.
Semakin jauh dari pl, kemampuan mengikat air semakin tinggi, dan sebaliknya
semakin mendekati pl, kemampuan mengikat air akan menurun dan mencapai
minimal pada pl
Purifikasi protein
Purifikasi Protein, merupakan teknik/metode yang dilakukan untuk
memisahkan protein dari komponen biomolekul lain, atau dari protein lain yang
berbeda berdasarkan sifat protein tersebut.
Sifat protein, antara lain:
Sifat kelarutan protein, dapat digunakan metode salting out, dan salting in,
untuk proses pemurnian protein.
Sifat muatan listrik pada protein; yang disebabkan oleh rantai samping COO-
dan NH3+, dapat digunakan metode kromatografi pertukaran ion,
elektroforesis, dan isoelekrik/pI, untuk proses pemurnian protein.
Sifat berat molekul yang berbeda/bervariasi pada protein, dapat digunakan
metode dialisis, elektroforesis gel, gel filtrasi, dan ultra sentrifugasi, untuk
proses pemurnian protein.
Sifat ikatan spesifik dari protein, dapat digunakan metode kromatografi
afinitas, untuk proses pemurnian protein.
Purifikasi protein berdasarkan size dan shape

Dialisis

Elektroforesis gel

Gel filtrasi

Ultrafilltarsi

Ultrasentrifugase
Dialisis
Dialisis merupakan proses pemisahan molekul pada suatu larutan dengan
menggunakan membran semipermiabel
Dasar metode dialisis,
Pemisahan molekul yang mempunyai berat molekul besar dari molekul yang
mempunyai berat molekul kecil melalui suatu membran selekstif
semipermaebel yang berpori.
Molekul yang kecil dapat dengan bebas melewati pori membran selektif
semipermeabel dari arah konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah, sampai
terjadi keseimbangan diantara kedua sisi membran.
Dialisis

Pemurnian protein dengan metode dialisis.


Elektroforesis gel
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran
berdasarkkan atas pergerakan partikel yang bermuatan dibawah pengaruh
medan listrik.
Prinsip:
Protein akan didenaturasi dengan menggunakan larutan dapar yang
mengandung SDS, dan muatan dari protein akan disamakan (menjadi
bermuatan negatif
Interaksi ini sebanding dengan ukuran molekul protein. Makin besar ukuran
molekul suatu protein, maka makin banyak muatan negatif hasil interaksi
protein dengan SDS.
Komplek protein terdenaturasi-SDS didalam gel poliakrilamid, jika diberikan
suatu medan listrik maka akan bermigrasi ke kutub positif (anoda).
Makin kecil molekul protein tersebut, maka makin jauh jarak yang ditempuh,
dengan demikian terjadi pemisahan protein berdasarkan berat molekul
protein.
Elektroforesis gel

(a) Peralatan elektroforesis. (b) Proses purifikasi protein dengan SDS-Page.


Gel filtrasi
Prinsip:
Memisahkan campuran molekul/protein berdasarkan perbedaan
berat dan ukuran molekul
Molekul yang memiliki ukuran lebih kecil daripada pori-pori
butiran yang ada di kolom, dapat masuk ke butiran-bitiran
tersebut, sehingga relatif tertahan di kolom, dan lebih lambat
keluar dari dari kolom.
Molekul protein yang memiliki ukuran lebih besar daripada
pori-pori butiran, dapat melewati sela/celah diantara butiran
sehingga lebih cepat keluar dari kolom.
Gel Filtration/Size Exclusion
Chromatography
Ultrafiltrasi
Fraksinasi protein dengan membran ultrafiltrasi
merupakan sistem yang yang menggunakan prinsip
hidrodinamika yang mempengaruhi peristiwa transmisi
dan rejeksi membran untuk tiap molekul yang
dipisahkan.
Sebuah membran dengan pori tertentu (membran
selektif permeabel) yang ukuran dari pori-pori dari
membran digunakan untuk fraksinasi protein
Ultrafiltrasi

Pemisahan protein dengan menggunakan metode ultrafiltasi.


Ultrasentifugase
Prinsip sentrifugasi didasarkan atas fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di
dalam suatu wadah (tabung atau bentuk-bentuk lain) akan mengendap ke dasar
wadah karena pengaruh gravitasi.
Berdasarkan kecepatan rotasi pada sentrifugase, dapat dikelompokan, antara
lain:
Sentrifugase dengan kecepatan rendah, yaitu: 2000-6000RPM/6000g.
Sentrifugase dengan kecepatan tinggi, yaitu: 18.000-25.000RPM/60.000g.
Sentrifugase sangat tinggi/ultrasentrifugasi, yaitu: >60.000g.
Ultrasentifugase
Kecepatan proses pengendapan (sedimentasi) suatu partikel atau molekul yang
disentrifugasi dipengaruhi oleh dua macam faktor, yaitu:
Berat molekul/BM, semakin tinggi BM suatu molekul, maka akan kecepatan
pengendapan semakin tinggi pula.
Bentuk molekul, gerakan suatu molekul melalui cairan akan dipengaruhi oleh
gaya gesekan. Molekul yang mempunyai bentuk lebih kompak akan bergerak
lebih cepat dalam cairan daripada molekul yang bentuknya kurang kompak,
meskipun memiliki BM yang sama.
Ultrasentifugase
Purifikasi protein berdasarkan net charge

Purifikasi protein berdasarkan muatan bersih/net charge,


dapat dilakukan dengan cara, yaitu: kromatografi
pertukaran ion.
Protein, dapat memiliki muatan negatif dan muatan
positif Muatan listrik pada protein disebabkan oleh
rantai samping COO- dan NH3+.
Fase diam disebut dengan Resin; Resin penukar kation &
resin penukar anion
Resin terbuat dari polidekstran, selulosa, atau silika
Purifikasi protein berdasarkan net charge

Muatan positif umumnya disebabkan oleh ionisasi dari asam amino,


antara lain: arginin, lisin, dan histidin, pH lingkungan juga
berpengaruh terhadap ionisasi asam amino.
Muatan negatif umumnya disebabkan oleh asam amino, yaitu:
aspartat dan residu glutamat dan kelompok Cterminal karboksil.
Jenis penukar ion
Purifikasi protein berdasarkan isoelectric
point
Purifikasi protein berdasarkan isoelectric point, bahwa kelarutan protein
dipengaruhi pH lingkungan dimana protein tersebut berada. Pada pH tertentu,
muatan positif suatu protein akan tepat sama (ekuivalen) dengan muatan negatif,
sehingga muatan keselurahan dari tersebut menjadi nol.
PH yang dapat membuat muatan positif dan negatif dari suatu protein menjadi
sama, disebiut pH isoelektrik atau pI/ isoelectric point. Nilai pI pada protein
umumnya berkisar dari 4 s.d 10.
Purifikasi protein berdasarkan isoelectric
point
IEF/ Isoelectric focusing, dapat dipergunakan untuk menentukan pH isoelektrik
(pI) dari protein. Teknik ini juga dapat diterapkan untuk pemisahan, identifikasi
dan menentukan kemurnian dari protein.
Protein dipisahkan berdasarkan nilai pI protein dalam media yang terdapat
gradein pH dengan konsentrasi yang berbeda. Untuk analisa gel, yang umum
digunakan adalah gel poliakrilamid atau gel agarosa.
Purifikasi protein berdasarkan
hydrophobicity
Purifikasi protein berdasarkan kepolaran, hal ini dikarenakan terdapat rantai samping
(gugus R-) pada asam amino yang bersifat hidrofobik. Purifikasi protein berdasarkan sifat
hidrofobik dapat dilakukan dengan cara, yaitu: kromatografi interaksi hidrofobik.
Fase stasioner/diam adalah suatu ligan yang hidrofobik yang dilekatkan pada matrik pada
kolom kromatografi. Namun jumlah ligan dan hidrofibitas (sifat tidak larut dalam air)
pada
Metode yang digunakan pada kromatografi interaksi hidrofobik adalah ikatan yang terjadi
antara ligan hidrofobik yang melekat pada adsorben pada kolom kromatografi dan
protein yang akan dipisahkan.
Purifikasi protein berdasarkan
hydrophobicity
Polaritas dari pelarut dapat diatur dengan penambahan garam atau pelarut
organik, yang berfungsi dapat memperkuat atau memperlemah interaksi ligan
hidrofopik dan protein.
Selain garam, pelarut organik dapat digunakan untuk melemahkan interaksi
hidrofobik, misalnya: glikol, asetonitril dan alkohol. Pelarut organik ini bekerja
dengan jalan mengubah polaritas dari fase bergerak pada kolom kromatografi,
sehingga melemahkan potensi interaksi hidrofobik yang mungkin terjadi.
Pelarut organik ini dapat ditambahkan selama proses elusi, untuk menggangu
interaksi hidrofobik dan mengelusi protein yang terikat pada adsorben.
Kromatografi Interaksi Hidrofobik
REKOMBINASI PROTEIN
Rekombinan Protein
Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari
protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk
menghasilkan sejumlah besar protein, melalui memodifikasi
urutan gen dan memproduksi produk komersial yang
bermanfaat.
Protein merupakan hasil akhir dari teknik rekombinan DNA
DNA rekombinan adalah teknik yang memasukkan suatu
materi genetik berupa urutan nukleotida yang diinginkan
kedalam suatu vektor, dan ditransfeksikan ke dalam suatu sel
host untuk diperbanyak dan diekspresikan.
DNA cloning
act of making many identical copies of a DNA
molecule

The simplest way:


Inserting a particular fragment of DNA into
purified DNA genome of a self-replicating
genetic element, such as plasmid or virus

Aims:
1. Propagation of DNA fragment
2. Production of desired protein in large amounts
Komponen Kloning Gen
Cloning
vector
(plasmid)
preparation

Plasmid untuk metode kloning, biasanya mempunyai


- Gen untuk resistensi terhadap antibiotik, misalnya
amphicilin resistance gene
- Polylinker, berisi fragment berbagai macam situs
restriksi untuk enzim restriksi (yang unik untuk setiap
plasmid)
- Replication of origin (ORI)
rDNA

38 Protein
E. coli
Pada umumnya, E. Coli tidak langsung mensekresikan
protein secara utuh ke ekstraselular melainkan dalam bentuk
rekombinasi protein. Terdapat 2 mekanisme dalam sekresi
protein pada E. Coli yaitu :
Tipe 1 protein langsung disekresikan dalam 1 tahap melewati
membran dalam dan membran luar dinding bakteri melalui
mekanisme transport haemolysin.
Tipe 2 protein disekresikan dalam 2 tahap yang lebih
kompleks
Pichia pastoris
Pichia is a methylotroph, meaning it can grow with the simple
alcohol methanol as its only source of energy
Pichia can easily be grown in cell suspension in reasonably strong
methanol solutions that would kill most other micro-organisms, a
system that is cheap to set up and maintain.
Pichia can grow to very high cell densities, and under ideal
conditions can multiply to the point where the cell suspension is
practically a paste.
As the protein yield from expression in a microbe is roughly equal to
the product of the protein produced per cell and the number of cells,
this makes Pichia of great use when trying to produce large quantities
of protein without expensive equipment.
Transformation efficiency is much lower than in for example E.
coli, and this is one of the drawbacks when using P. pastoris as host for
recombinant protein expression
Keunggulan P.pastoris
P. pastoris memiliki promotor gen yang diregulasi dengan
ketat, yaitu gen AOX1
Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi,
hal ini disebabkan pada konsentrasi sel yang tinggi, P. pastoris
tidak menghasilkan etanol yang merupakan racun bagi sel;
dan
P. pastoris biasanya menyekresikan sangat sedikit proteinnya
sendiri, sehingga memudahkan pemurnian protein
rekombinan yang disekresikan
Seleksi Koloni Bakteri rekombinan
Prinsip Pemurnian Protein Rekombinan
1. Memekatkan larutan kultur, dengan volume lebih kecil
purifikasi dapat berjalan lebih baik
2. Menghilangkan sebagian besar kontaminan, termasuk DNA
yang berasal dari media kultur
3. Setelah purifikasi senyawa yang didapat harus
dikarakterisasi berdasarkan sifat fisik dan kimianya
Kromatografi affinitas
Teknik pemisahan molekul dengan cara pengikatan molekul
yang diteliti secara kovalen dengan matriks immobile.