Protein Rekombinan
Ambar Listyorini Pidia Awalia N
Asraq Fahruzzaman Primo Bittaqwa
Badriyatun Nimah Putri Agni K
Ervina Octaviani Ratih Dara Syadillah
Fitrahtunnnisah Silviana Adhitya
Haka Asda Tri Wahyuni
Hesti Sulistiorini Ummum Nada
Marrisa Vishilpy Dimalia
Muhammad Akbar
Najmah Mumtazah
Kelompok 2 AC
Protein Rekombinan
Rekombinan protein adalah suatu bentuk
manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam
berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar
protein, memodifikasi urutan gen dan
memproduksi produk komersial yang bermanfaat.
Protein rekombinan merupakan protein yang
diperoleh dari hasil teknologi DNA rekombinan.
Melalui teknologi DNA rekombinan dapat dilakukan
pemindahan gen pengode enzim/protein dari satu
organism ke organisme lain.
TEKNIK PRODUKSI PROTEIN
REKOMBINAN
ISOLASI DNA GENOM, RNA TOTAL
DAN POLY(A) RNA
DNA genom berupa untai ganda dan dapat diisolasi dari sel jenis
apapun, termasuk bakteri, ragi, tanaman dan binatang.
Hasil isolasi DNA yang diinginkan adalah DNA seutuh mungkin, tidak
rusak dan memiliki berat molekul tinggi.
Beberapa jenis RNA dapat ditemukan dalam sel, termasuk messenger RNA
(mRNA), ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) dan lain-lain.
Kebanyakan studi (Northern blot, RT-PCR) cukup menggunakan hasil isolasi
RNA seluler total.
Untuk beberapa aplikasi, total RNA seluler tidak cukup baik digunakan.
Dari total RNA sebagian besar berupa rRNA, sedangkan mRNA hanya 1-
3%.
1. Isolasi DNA Genom Total
Suspensi sel-yang-mengandung-
DNA diinkubasi dengan deterjen dan
atau enzim yang berfungsi untuk
melisis sel/inti
http://images.the-scientist.com
mRNA (biasanya diterjemahkan (translasi)
ditranskripsikan secara menggunakan ribosom
in vitro dari cDNA yang yang ada dalam lisat
diklon dalam plasmid) retikulosit.
untuk enzim-enzim,
Protein yang
reaksi katalisis,
ditranslasikan secara in
imunopresipitasi, uji
vitro dapat digunakan
interaksi DNA-protein,
sebagai substrat
dan lain-lain.
Ekspresi protein rekombinan
dalam E. Coli
Paling baik digunakan untuk ekspresi protein
intraseluler yang relatif kecil dan tidak memerlukan
modifikasi pascatranslasi (posttraslational
modification) yang terlalu banyak untuk dapat
berfungsi.
Menambahkan label/marka (tag) yang telah dipurifikasi
kepada protein yang diekspresikan untuk memudahkan
menemukan protein setelah diekspresikan.
Marka yang banyak digunakan adalah glutation-
Stransferase (GST) yang dapat diisolasi menggunakan
kolom glutation atau marka histidin untuk isolasi
menggunakan kolom nikel.
Kerugiannya :
ketidakmampuan
untuk melakukan
prosessing kompleks
seperti glikosilasi
beberapa protein
bersifat labil (atau
toksik) pada hospes.
protein yang besar
biasanya tidak
diproduksi atau tidak
terlipat (folding)
dengan efisien.
Keuntungan sistem
ekspresi pada E. coli :
- mudah untuk
melakukan manipulasi
DNA rekombinan (mirip
seperti kloning
plasmid) dan proses
seleksi
- ekspresi yang cepat.
Yeast protein expression systems
Saccharomyces cerevisiae
Sistem genetik yang sangat berkembang,
penggunaannya mudah, berkurangnya waktu dan biaya
membuat S. Cerevisiae menjadi organisme yang
menarik untuk diekspresikan dan memproduksi protein
rekombinan.
Ragi mampu membawa plasmid yang dirancang khusus
dan kemampuan ini berfungsi dalam sistem ekspresi
protein rekombinan. Plasmid terdiri dari situs restriksi
yang dapat digunakan untuk memasukkan urutan gen
yang diinginkan. Transformasi dari ragi dengan plasmid
menghasilkan protein yang diinginkan dan dapat
ditingkatkan.
Features
low cost culture
methods
suitable for both
intracellular and
secreted proteins
provides eukaryotic
post-translational
glycosylation of
proteins although it
results in high
Ekspresi protein rekombinan
dengan bantuan baculovirus
Ekspresi yang dibantu oleh
baculovirus dalam sel serangga
adalah satu cara lain yang
umum digunakan untuk
ekspresi protein rekombinan.
Tingkat ekspresi yang tinggi
akan memudahkan purifikasi,
kecuali jika terjadi agregasi.
Namun, untuk melakukan
seleksi dan rekombinasi
sejumlah besar protein mutan
pada sistem ini masih agak
sulit.
terjadi rekombinasi dengan DNA
baculovirus dalam sel Sf9
Mentransfer plasmid yang sehingga sekuens DNA yang
mengandung cDNA yang menyandi protein mantel virus
dikehendaki (coat protein) utama, polyhedrin,
diganti dengan protein yang
dikehendaki.
Konvensio
Modern
nal
Konvensional Modern
- menerapkan biologi, biokimia, telah menggunakan teknik rekayasa
atau rekayasa masih dalam tingkat tinggi dan terarah sehingga
hasilnya dapat dikendalikan dengan
tingkat yang terbatas. baik.
- menggunakan jasad hidup Teknik yang sering digunakan adalah
secara utuh. dengan melakukan manipulasi
- contoh, di bidang teknologi genetik pada suatu jasad hidup
pangan adalah pembuatan bir, misal rekayasa genetika, kultur
roti, maupun keju yang sudah jaringan, rekombinan DNA,
pengembangbiakan sel induk,
dikenal sejak abad ke-19. kloning, dan lain-lain.
- Di bidang medis, penerapan Teknologi ini memungkinkan untuk
bioteknologi di masa lalu memperoleh penyembuhan penyakit-
dibuktikan antara lain dengan penyakit genetik maupun kronis yang
penemuan vaksin, antibiotik, belum dapat disembuhkan, seperti
dan insulin walaupun masih kanker ataupun AIDS.
dalam jumlah yang terbatas Beberapa prinsip dasar dalam
rekayasa genetika, yaitu DNA
akibat proses fermentasi yang rekombinan, fusi protoplasma, dan
tidak sempurna. kultur jaringan.
PERBEDAAN BIOTEKNOLOGI KONVENSIONAL DAN
MODERN
Konvensional Modern
Memakai makhluk hidup dan komponennya
Langsung menggunakan secara langsung
makhluk hidup dan belum Menggunakan prinsip-prinsip ilmiah
mengetahui penggunaan enzim
Hasil pengkajian berbagi disiplin ilmu yg
Tanpa didasari prinsip ilmiah mendalam
Berdasarkan keterampilan yang Diproduksi secara masal
diwariskan turun temurun Mengupayakan membuat produk dengan
Tidak sepenuhnya diproduksi efektif dan efisien
secara masal Didasarkan pada manipulasi atau teknik DNA
disamping menggunakan dasar mikrobiologi
Bioteknologi yang dan biokimia
menggunakan mikroorganisme Tidak hanya digunakan pada industri
untuk memproduksi alkohol, makanan namun juga telah meliputi banyak
asam asetat, tempe, tahu, bidang, seperti teknik genetik.
oncom, dll Dengan beragamnya penelitian dan
perkembangan keilmuan serta teknologi,
keuntungan yang lebih besarpun didapatkan.
Contoh-contoh
Hormon
Contoh: Hormon Insulin. Penderita penyakit Diabetes mellitus
kekurangan hormon insulin sehingga kadar gula dalam darahnya sangat
tinggi. Dengan adanya bioteknologi, saat ini hormon insulin telah dapat
dihasilkan secara buatan (transgenik) dengan bantuan bakteri
Escherichia coli. Pembuatan insulin dilakukan dengan menyisipkan gen
insulin ke dalam bakteri. Pada sel bakteri E. coli, dimasukkan DNA sel
manusia yang mengandung gen insulin sehingga bakteri E. coli dapat
menghasilkan insulin. Karena bakteri dapat berkembang biak dengan
cepat maka hormon insulin pun dapat dihasilkan dalam jumlah yang
banyak. Kini, insulin mudah didapatkan oleh penderita diabetes mellitus
dalam bentuk cair.
Vaksin
Contoh: Vaksin Hepatitis B dan malaria. Secara konvensional pelemahan kuman
dilakukan dengan pemanasan atau pemberian bahan kimia. Dengan
bioteknologi dilakukan fusi atau transplantasi gen.
Contoh Produk Farmasi Berbasis Bioteknologi
Protein Rekombinan
Sistem ekspresi yang berdasar pada
promotor arabinosa dalam E. coli
untuk produksi dan pemurnian
rekombinan hormon pertumbuhan
manusia (rhGH).
hGH hGH1
Peptida kecil, satu-rantai dari 191
Hormon protein heterogen, terdiri residu, diproduksi dan disekresikan
dari beberapa isoform dan gen GH oleh kelenjar hipofisis anterior.
cluster pada kromosom 17q yang Protein ini bertanggung jawab
berisi 2 gen GH (GH1 atau GH-N untuk efek dalam metabolisme
dan GH2 atau GH-V) selain itu 2 protein, karbohidrat dan lipid serta
sampai 3 gen yang mengkode pertumbuhan dan kekebalan
terkait chorionic (Jorgensen, 1987) dan digunakan
somatomammotropin (Baumann, dalam pengobatan dwarfisme
2009). hypopituitary (Hindmarsh dan
Brook, 1997).
Eschericia coli
Berbagai sistem ekspresi telah Aspek yang menarik dari sistem
dicoba untuk ekspresi hGH: E. coli sehubungan dengan hGH
Bacillus subtilis (Franchi et al., 1991), adalah rhGH telah diuji untuk
sel mamalia seperti CHO (Dallia et al. ekspresi dalam ruang
2003), periplasmic E. coli (Chang et al,
sistem baculovirus (Geng et al., 2002) 1987;. Ghorpade dan Garg,
dan
1993) dan di sitoplasma sebagai
ragi seperti Pichia pastoris (Ascacio-
Martinez dan Barrera-Saldana, 2004;. badan inklusi (Mukhija et al,
Deshpande et al, 2009). 1995; Schoner et al, 1992).
pBAD24
Protein yang terlipat kembali (3400 ml) Badan inklusi yang terlarut
buffer nya ditukarkan dengan 20 Mm
Natrium asetat pH 4,5 mengandung kemudian melipat kembali dalam
2,5% sukrosa, 0,2 Tween 80 dan 0,5 volume 10 dari 50 Mm Tris.Cl, pH 8,8
Mm EDTA (buffer seimbang). dengan metode dilusi cepat.
Purifikasi dan Analisis dari rhGH murni
Protein-protein
Setelah buffer yang terikat
bertukar, dielusi dengan
gradient linear
Kolom dicuci dengan buffer seimbang sampai 0.0-1.0 M NaCl
protein diperjelas DD280 dicapai nol pada 20 mM
dengan Natrium Asetat
sentrifugasi pada pH 4,5
13000 rpm untuk elusi dari protein-protein terikat diteruskan mengandung
15 menit dengan menggunakan gradient linear dari 2,5% sukrosa, 0,2
larutan NaCl (0.0-1.0 M) pada buffer yang % tween 80 dan
sama di dalam sistem purifikasi protein o,5 mM EDTA
supernatant yang explorer AKTA (GE Heathlcare, Sweden). pada volume
dihasilkan (4080
1870 ml.
ml) diisi pada
kolom penukar Aliran yang melalui fraksi (4780 ml)
anion (Q mengandung protein hGH kemudian diisi Kemurnian dari
Sepharose FF, GE pada kolom penukar kation (SP Sepharose, FF hGH diperiksa
Healthcare, GE Healthcare, Sweden) dengan
Sweden) pada mensubjekan
laju alir 8 protein pada SDS
ml/menit. PAGE diikuti oleh
pewarnaan silver.
Mengkarakterisasi dari rHGH murni
Data ditampilkan sebagai eliptisitas molar (mdeg) versus panjang gelombang (nm)
dan elemen structural sekunder dideterminasi dengan menggunakan tool k2D online
(http://www.emblheidelberg. de/~andrade/k2d) pada IISC, Bangalore, India.
rhGH murni juga dianalisi pada bioanalizer Agilent 2010 :Instrumen elektrophoresis kapiler
generasi baru dengan mikrofluida berbasis platform yang tersedia secara komersial.
Mengkarakterisasi dari rHGH murni
Setelah pencucian secara extensive, plate diinkubasi dengan 1:750 didilusi antibody anti
hGH kelinci pada 37C untuk 1 jam diikuti dengan inkubasi kambing anti kelinci IgG-HRP.
3,3,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) digunakan substrat chromogen dan
absorbansi dibaca pada 370 nm setelah 30 menit.
HASIL
Pemilihan pBAD24-hGH dan
pBAD 24M-hGH rekombinan
pBAD24M-hGH
Hasil Ekspresi rhGH dalam Biorekator
Pada proses fermentasi pBAD24-hGH dan pBAD 24M-hGH dengan keadaan lingkungan
yang sama, terlihat pola pertumbuhan yang sama tetapi tingkat ekspresi rhGH pada
pBAD24MhGH hampir 25x lebih tinggi dibandingkan dengan pBAD24-hGH (gambar 3).
Dan nilai OD rHG pada pBAD24-hGH hanya 75 mg/mL dan pada pBAD24MhGH
sebanyak 1.862 mg/Ml dengan kondisi yang sama (tabel 1)ketika diukur dengan
densitometer, hasil penelitian menunjukan badan inklusi pada pBAD24- hGH hanya
1,8% sedangkan pada pBAD24M-hGH sebanyak 59% dari total protein
Purifikasi dari bakteri Hgh
pada proses purifikasi, dilakukan
dua proses, yaitu
1. Menggunakan ion Q
Sepharose FF , menghasilkan
Hgh dengan tingkat
kemurnian 66%. karena
adanya muatan negatif pada
proses ini juga menghapus
kontaminan dari DNA host
2. hGh dimasukan kedam kolom
(SP sepharose FF) dan
protein yang masih terikat
dan dielusi sehingga
mendapatkan tingkat
kemurnian yang tinggi >95%,
dengan peroehan kembai
40%
Karakterisasi rhGH murni
Pada proses karakterisasi rhGH murni dimana,
terdapat 3 proses, yaitu :
1. menggunakan proses
Squencing N-terminal dimana urutan Pada rhGH
yang didapat cocok dengan N-terminal pada
growth hormon manusia
2. Menggunakan MALDI-TOF/TOF dan
menunjukan adanya 86% karakterisitik peptida
untuk somatotropin manusia.
menggunakan
Bioanaizer Agilent 2100
dengan waktu retensi
yang sama dengan
rHgh murni
somatotropin komersial
komersial
menunjukan nilai CD
(Circular dichroism)
85%
pada peneitian ini
aktivitas biologi dari
rhGH yang telah
dimurnikan memiliki
aktivitas yang hampir
sama dengan
somatotropin yang
tersedia secara Keterangan
komersial. Hitam : Hgh komersial
Putih : hasil Hgh yang telah dimurnikan
DISCUSSION
Manajemen
terhadap
kekerdilan
pada pituitari
(dwarfisme)
Pengobatan
patah tulang
hGH expression
Fungsi Solusi
Selanjutnya
dikembangkan
dengan teknik Dengan adanya
rekombinan pada : teknologi molekuler
Pada awalnya tPa
- Aspergilus nidulans farming,
berasal dari ekstraksi
dikembangkan lah
Human Bowes - Sel mamalia rekombinan protein
Melanoma Cells
- Sel insekta pada tanaman
mentimun
- S. Cerevisiae
- E. coli
Alasan Pemilihan
Alasan :
Mentimun :
DNA yang Tanaman dapat
Karena mentimun
mengandung tPa memproduksi protein
banyak tersebar
ditransfer kedalam tanpa mengubah
didunia. Sebanyak 2,5
nukleus tanaman struktur asli tanaman.
juta hektar dunia
dengan bantuan Molekuler dalam
ditanami tanaman
Agrobacterium pertanian memiliki
mentimun dan 42,5
potensi yang tidak
juta ton yang dipanen
terbatas
didunia
Keuntungan Menggunakan Teknik
Molekuler Farming
Molekuler Farming adalah
suatu proses penggunaan
Tanaman dapat tumbuh pada
tanaman dan hewan yang
Tanaman dapat skala pertanian yang cukup besar direkayasan secara genetis
memproduksi protein hanya dengan air, mineral dan sebagai suatu materi baru
kompleks yang tidak cahaya matahari. Dibandingkan
dapat diproduksi oleh dengan kultivasi sel mamalia yang
dan termodifikasi (Davies
yeast atau bakteri membutuhkan proses yang lebih and Chambers, 2000)
sulit dan mahal
Tanaman dapat
memproduksi protein
dalam jumlah banyak
pada jaringannya
(Norris, 2005)
Bahan dan Metode
Plasmid dan Bakteri
cDNA dari gen tPA manusia dengan situs restriksi Sac I dan
Bam HI di kloning ke dalam ekspresi tanaman vektor pBI121
yang mengandung kembang kol mosaik virus promotor
CaMV 35S, urutan terminator transkripsi (NOS), dan gen -
glucuronidase.
Untuk
memverifikasi
regenerasi yang
tepat, eksplan
Setelah 6 hari, kotiledon tanaman
kotiledon diisolasi mentimun
Biji mentimun ditempatkan pada
didesinfeksi dari batang dengan
melengkung dan media MS dengan
dibagi menjadi 5x5- hormon naftalen
mm asetat (NAA) dan
konsentrasi yang
berbeda hormon
purin amino benzil
(BAP)
Analisis PCR dan RT-PCR
Karena tanaman resisten terhadap antibiotik kanamisin mungkin
tidak benar untuk tanaman reansgenik-untuk contoh, sel-sel
tumbuhan hanya menerima vektor (tanpa tPA gen) reaksi PCR
digunakan untuk mengkonfirmasikan keberadaan gen. Ekstraksi
DNA dari daun mentimun muda segar diregenerasi pada medium
selektif yang dilakukan melalui Metode CTAB. Keberadaan gen
tPA diselidiki dalam sel tumbuhan mentimun yang diregenerasi
pada media selektif dengan reaksi PCR dan tPA gen spesifik
primer.
Urutan dari primer adalah sebagai berikut:
F -tPA: 5GAGTCTAGATAAACAATGGATGCAATGAAGAGAGGG 3
R-tPA: 5ATAGTCAACTCATAGCTCATCTTTCGGTCGCATGTTG 3
Kondisi yang diperlukan untuk proliferasi DNA dari gen tPA termasuk
denaturasi awal 180s/950C, 35 siklus denaturasi 60s/950C, annealing 30s/600C,
dan elongasi 120s/720C. Produk PCR diperiksa pada 1% gel agarose dan Gelred.
Daun muda mentimun transgenik dan larutan RNX-Plus (Synagene, Inc)
digunakan untuk ekstraksi RNA. Pembangunan cDNA dilakukan
menggunakan kit ekstraksi cDNA (Fermentase Co).
Reverse-transkripsi (RT) -CR reaksi dan primer spesifik (dirancang dari gen tengah)
yang digunakan untuk ekspresi gen tPA di sel tumbuhan mentimun transgenik.
Urutan primer adalah sebagai berikut:
F -tPA: 5TGGGGAACCACAACTACTGCAGAAAC 3
R-tPA: 5GAAACCTCTCCTGGAAGCAGTGGG 3
Pertama, 20 ng protein
Produksi dari protein
Untuk menggunakan teknik absolut tPA (kontrol positif)
rekombinan tPA pada sel
ini untuk mendeteksi dan protein yang
timbuhan ketimun
produksi protein diekstraksi dari daun
transgenik telah diteliti
rekombinan tPA pada transgenik dan tumbuhan
melalui teknik dot blot dan
ekstrak tumbuhan non-transgenik (sebagai
menggunakan antibodi
transgenik, kontrol) yang ditempatkan
yang spesifik.
di atas kertas nitroselulosa.
ELISA telah digunakan untuk penetuan secara kuantitas dari protein rekombinan
tPA relatif terhadap protein terlarut pada tanaman ketimun transgenic
Tujuannya, setelah penentuan densitas dari protein yang telah diekstrak pada
tanaman transgenik maupun daun non transgenik dengan spektrofotometer, 50
ng setiap sampel ditempatkan pada piring dengan 5 kali pengulangan.
Dan juga, untuk prosedur kurva standar, digunakan enam konsentrasi protein tPA
yang berbeda.
Variasi dalam intensitas warna pada sampel kontrol positif (C+; protein tPA murni)
mungkin karena perbedaan konsentrasi yang tidak diinginkan.
Perbedaan antara tanaman non-transgenik (wt) karena adanya kotoran dalam ekstrak
protein
Sistem produksi
protein rekombinan
farmasi menggunakan
sistem mikroba,
serangga dan kultur
sel mamalia, dan Produksi
hewan transgenik protein pada
memiliki kelemahan tanaman
dalam hal : meningkat
Biaya produksi
Keamanan produk
Integritas
Obat protein tPA lebih disukai dibandingkan
dengan obat lain yang serupa.
Waktu paruh plasma berkurang pada
Reteplase, Saruplase, Lanutplase dan dosis
lebih rendah daripada Reteplase dan
Lantuplase.
Spesifisitas tPA jauh lebih besar daripada
streptokinase. Namun, perkiraan biaya setiap
perlakuan lebih besar dibanding streptokinase
Dalam penelitian ini, ditemukan bahwa dengan banyaknya produksi tanaman mentimun
pengobatan penyakit menjadi lebih mudah
Adanya tiga faktor regulasi ekspresi yaitu (CaMV 35S, Kozak, NOS) dan
KDEL menyebabkan peningkatan ekspresi gen tPA pada tanaman
mentimun
Cara evaluasi, faktor, dan metode lain untuk meningkatkan efisiensi transfer gen untuk
produksi protein tPA pada mentimun dan tanaman lainnya dianjurkan.
SDS - PAGE
Tujuan: Identifikasi dan pemurnian
protein spesifik (protein rekombinan
tPA)
Pada Jurnal ini hasil pita pada garis
o Wt= sampel control yaitu tanaman
timun non-transgenic
o L= Marker molekul protein
o 1-3= Sampel Tanaman timun
transgenic