INSECT CELL CULTURE IN

REAGENT BOTTLES

KELOMPOK 5

Ardita Rizky Putri A. [1306402293]

Muh. A. H. Vinci Kurnia [1306403390]
Nugrahirani Hijrianti [1306402766]
Nurul Hidayah [1306371060]
Satria Pasthika [1306371041]
Trisiana C. Sandralintang [1306371054]
 PENDAHULUAN
Kultur sel adalah pembudidayaan / pemeliharaan
sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam
lingkungan buatan yang steril/sesuai

Kultur sel dibagi berdasarkan sel yang digunakan:

Sel Prokariotik Sel Tanaman

Sel Eukariotik Sel Mammalia

 PENDAHULUAN
PROSES PERKEMBANGAN KULTUR SEL
Skala besar
produksi material klinis
dibawah peraturan cGMP
Ditransfer menjadi (current good
skala pilot manufacturing practices)
menguji skalabilitas dan
Optimalisasi media produksi material untuk
dan proses dalam penelitian toxicology
sistem skala kecil preklinis
Generasi dan (plate 96-well, shaker,
pemilihan sel lini dan bioreaktor skala-
bench)
 Komponen Kultur Sel
Sel inang

Vektor ekspresi

Metode transfeksi dan seleksi pada generasi lini sel

Media kultur sel standard

Kontrol proses

Metodologi scale up saat optimalisasi proses

 PROSPEK
KULTUR
PEMANFA-
SEL
ATAN
HEWAN
KULTUR

ANALISIS KULTUR SEL

PERTUMBUH
-AN SEL SERANGGA

METODE ALAT DAN

KULTUR BAHAN
 Kultur Sel Hewan (Animal tissue / cell culture KULTUR
SEL
HEWAN
merupakan metode untuk Sel hewan sulit
mempelajari tingkah laku atau untuk dijadikan kultur
sifat-sifat sel hewan dalam
karena:
keadaan fisiologis maupun dalam
Yield rendah
kondisi artifisial karena suatu
Media yang kompleks
perlakuan (treatment). Pada
Dibutuhkannya serum
awalnya yang digunakan untuk
Sensitif terhadap
kultur adalah jaringan sehingga
pergeseran
kembangkan kultur jaringan
menjadi istilah yang digunakan.
Langkah Langkah Dasar Kultur Sel Hewan

Menyiapkan peralatan kultur yang akan dipakai

Mengambil organ atau jaringan yang dikehendaki untuk dibuat kultur selnya
Mencuci organ atau jaringan di dalam larutan garam seimbang
Memindahkan ke dalam wadah lain yang berisi larutan garam seimbang segar
Memindahan bahan yang akan dikultur ke dalam sterile bench
Melakukan penyiapan sel untuk dikultur
Langkah Langkah Dasar Kultur Sel Hewan (cont)
Penyiapan secara mekanis dilakukan dengan
memotong organ atau jaringan, mencuci
potongan tersebut menggunakan larutan
garam seimbang, memindahkan potongan
(ekplan) ke dalam wadah yang berisi larutan
garam seimbang segar, menanam eksplan ke
dalam cawan atau botol kultur dan
menambahkan medium kultur yang telah
ditambahkan dengan serum dan memelihara
kultur di dalam inkubator CO2 dengan suhu
yang sesuai. Fungsi larutan garam seimbang
adalah untuk memberikan lingkungan fisiologis
dan fisik yang baik bagi sel selama sel,
jaringan atau organ dipersiapkan.
Penyiapan secara enzimatis dilakukan dengan
memindahkan eksplan ke dalam labu erlenmeyer
dengan adanya larutan tripsin 5% di dalam medium
tanpa serum, mengaduk suspensi di atas magnetic
stirrer dengan kecepatan sedang, setelah didapkan
suspensi sel, barulah menambahkan medium yang
mengandung serum kemudian melakukan sentrifuge
dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit.
Kemudian membuang supernatan dan mengganti
dengan medium segar yang mengandung serum.
Untuk kultur yang melekat menanam sebagian sel ke
dalam cawan atau botol kultur untuk kultur melekat
dan menambahkan medium yang mengandung serum
10% dan memelihara kultur sel di dalam inkubator
CO2 dengan suhu yang sesuai.
 Definisi Kultur Sel Serangga

Suatu kultur pada serangga dapat

dengan kultur sel pada teknik KULTUR SEL
pemeliharaan sel dalam kondisi invitro, SERANGGA
seperti kondisi in-vitro, kultur sel
serangga mempertahankan karakteristik
sel seperti saat sel tersebut berada di
dalam kondisi in-vivo
 Bagian Sel serangga
yang dikultur
Bagian sel serangga yang dikultur adalah
bagian yang dapat inti dari suatu sel serangga
dan atau dapat dispesifikasikan secara jelas
pada makalah ini menggunakan sel Sf9 atau
Sf21 yang diidentifikasikan melalui komputer
 Cara Umum Mengultur Sel

Serangga secara mekanis Sel sel

diisolasi dari Sel hewan dan secara sebagian
organ dipisahkan enzimatis dipelihara di
suspensi

Suhu untuk Dipelihara dalam Sebagian

kultur sel medium yang dipelihara di
serangga = dilengkapi serum di kultur yang
39O Suhu yang sesuai melekat
 Parameter Keberhasilan
Ukuran keberhasilan yang dapat digunakan
dalam pembuatan kultur ini adalah tidak
adanya kontaminasi pada kultur, kesehatan
sel selama dipelihara di dalam kondisi in-vitro,
dan keberhasilan sel memperbanyak diri.
Reagent Aluminium Bola Screw- Laminar
Autoclave
Bottles Foil caps Flow

Air Pore Shaker Erlenmeyer

Bioreactor Microscope
Tape Sheet Incubator Flask

Vi-CellTM XR Sterilizing bag atau ALAT

cell counter suitable container
 Reagent Bottles (Cat. No.
100389, VITLAB)
Bottle digunakan sebagai wadah
untuk menumbuhkan sel
BOLA screw-caps
BOLA screw-caps digunakan untuk
menggantikan aluminium foil sebagai
prnutup botol. BOLA srew-caps
membuatnya mudah untuk
mengambil sampel selama kultur .
Alumminium Foil
Aluminium foil digunakan untuk
menutupi jalan keluar dan masuknya
sel agar terhindar dari kontaminan.
Autoclave
alat untuk mensterilkan peralatan
dan perlengkapan dengan
menundukkan material untuk uap
tekanan tinggi jenuh pada 121 C
selama sekitar 15-20 menit,
tergantung pada ukuran beban dan
isi.
 Laminar Air Flow
Meja kerja steril untuk melakukan kegiatan
inokulasi/ penanaman dalam kultur in vitro.
Alat ini diberi nama Laminar Air Flow
Cabinet, karena meniupkan udara steril
secara kontinue melewati tempat kerja
sehingga tempat kerja bebas dari, debu
dan spora-spora yang mungkin jatuh
kedalam media pada waktu pelaksanaan
penanaman.
Loosened BOLA caps on
Digunakan untuk mensterilkan
botol Reagan.
Air Pore tape sheet ( Cat. No.
19571, Qiagen)
Digunakan untuk menutupi
pembukaan caps selama proses
pergantian aluminium menjadi
BOLA caps.
Shaker incubator
Dapat digunakan untuk diluted
culture
 Vi-CellTM XR cell counter Erlenmeyer Flask
Digunakan untuk mengoptimalkan dan Erlenmeyer flask digunakan sebagai
memonitor perilaku pertumbuhan, selain culture volumn.
jumlah sel hidup, parameter lain juga
harus dipantau. Diameter sel, distribusi Sterilizing bag atau suitable
seragam sel dalam jangka ukuran dan container
bentuk, perdu atau agregasi, penampilan
granular dalam sel, secara kolektif Digunakan untuk mensterilkan BOLA
memberikan status cells screw-caps

Bioreactor
Bioreaktor 50 digunakan untuk
studi ekspresi skala kecil untuk
volume budaya dari 5 ml sampai
30 ml.
Microscope
Kegunaan microscope sama
dengan Vi-CellTM XR cell counter
o SF9 atau SF21 cells (Spodoptera frugiperda)
SF9 atau SF21 merupakan sel serangga yang
akan dikultur.
o Protein (kinase)
Protein (kinase) merupakan biokatalis yang
digunakan untuk mempercepat reaksi.
o SF-900TM III SFM medium
SF-900TM III SFM medium merupakan tempat
untuk mengkultur sel. Medium tersebut berisi
nutrisi, hormon, vitamin, yang dibutuhkan sel
untuk memperbanyak diri.
BAHAN
Media kultur merupakan medium untuk menumbuhkan sel yang berisi
nutrisi.

Komposisi nutrisi dalam media kultur yaitu:

1. unsur makro : Nutrisi utama sel yaitu C, H, O, P, K, N, S, Ca, Fe, Mg.
2. unsur mikro : Nutrisi pelengkap yaitu Mn, Zn, Cu,B, Cl.
3. unsur tambahan (supplement) : seperti Gula, Myo-inositol, air
kelapa, casein hydrolisat, dll
4. vitamin dan mineral : seperti glysine, thyamine, pyridoxine, nicotiamine
5. zat pengatur tumbuh (hormon) : seperti Auksin, Sitokinin, Giberellin,
dll

MEDIA
KULTUR
Komposisi nutrisi dalam
media kultur berbeda-beda
karena disesuaikan dengan
tujuan kultur sel. Pada
kultur sel ini, media kultur
yang digunakan yaitu SF
900III Medium.
 Spesifikasi dari Sf-900 III SFM
Form Liquid
Species Spodoptera frugiperda, S. frugiperda
Cell Line Sf21. Sf9
Glutamine L-Glutamine
Serum Level Serum-Free
Product Size 1,000 Ml
Classification Animal Origin-Free, Serum-Free, Protein-Free
Green Features Sustainable packaging
Shipping Condition Room Temperature
 Komposisi medium
sf 900 iii SFM adalah medium lengkap 1X bebas
serum yang mengandung L-glutamine, Luronic F-68,
dan 5 mL / L penisilin-streptomisin dapat digunakan
bila diperlukan.
Serum adalah cairan bening yang
Serum dipisahkan dari sel-sel darah
menggunakan sentrifus.

1. Mengurangi biaya
Bebas serum 2. Mengurangi kontaminasi
3. Mengurangi penderitaan hewan
 Kelebihan Sf-900 III SFM medium
untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan pemeliharaan
Spodoptera frugiperda (Sf9 dan Sf21) sel
Dioptimalkan untuk produksi protein rekombinan
Dapat memulihkan sel-sel dari frozen stocks
cocok untuk metode kultur suspensi dan monolayer dan
mendukung pertumbuhan sel lepidopteran lainnya.
Sf-900 III SFM siap untuk digunakan; tidak
memerlukan penambahan serum, glutamin, atau
surfaktan
 Pertumbuhan sel serangga dalam botol reagen
memberikan alternatif yang lebih baik untuk
melaksanakan kultur multi-paralel dalam volum yang
berkisar 0,25 5 L.
A. Persiapan
Botol Reagen B. Pertumbuhan rutin
untuk Kultur Sel dan pemeliharaan
sel-sel

METODE
KULTUR
 A. Persiapan Botol
Reagen untuk Kultur Sel
1. Botol reagen. Buka penutup dan pelapis dari botol reagen. Reagen botol yang baru
biasanya akan berada pada kondisi non steril.
2. Tutup Bola Sekrup kemudian ditempatkan pada wadah steril atau tempat lain yang sesuai.
3. Sterilisasi botol dan tutup dengan autiklaf (121 0C, 15 psi, 15 menit).
4. buka penutup aluminium foil dan diganti dengan BOLA-caps pada unggun aliran laminar.
Pembukaan caps ditutupi dengan lembar pita AirPore.
5. Atau, pita AirPore dapat digunakan langsung pada botol. Menggunakan topi BOLA yang
membuatnya mudah untuk mengambil sampel selama proses kultur jika diperlukan.
6. Botol dapat disterilkan dengan melonggarkan BOLA caps-nya, lalu tutup dengan aluminium
foil.
 B. Pertumbuhan Rutin dan
Pemeliharaan Sel-sel
Sf9 atau Sf21 sel disesuaikan dengan kultur suspensi dalam media Sf-900TM III SFM
yang tumbuh menuju fase log. Inilah yang akan berfungsi sebagai pemasok utama.
Sebuah alikuot sel diambil dari pemasok utama dan diencerkan dengan media segar
untuk menginisiasi 50 ml kultur starter dalam 250 ml labu Erlenmeyer. Rekomendasi
density awal adalah (0,7-0,8)x106 sel per ml.
Kultur yang terdilusi diinkubasi pada 270C dengan 90 rpm dalam shaker inkubator.
Jumlah sel dan viabilitas dianalisis dengan menggunakan sel Vi-CellTM XR counter. Hal
ini perlu dilakukan untuk memeriksa parameter sel setiap hari dalam kurun waktu
beberapa hari pertama yang akan memberikan ide pada frekuensi fasa yang
diperlukan. Biasanya sel diperiksa dua kali seminggu, pada hari ke-3 dan hari 7.
Dalam sekali monitoring, sel yang layak hidup mencapai sekitar (8-9)x106 sel per ml
dengan menambahkan media segar untuk kepadatan (0,7-0,8) x106 sel per ml,
sebagaimana disebutkan dalam point 2 di atas.
 TUJUAN PERCOBAAN
1. Melihat korelasi pertumbuhan sel
serangga di antara wadah kultur
ANALISIS
yang berbeda
PERTUMBUH- 2. Mengamati perilaku pertumbuhan
AN SEL dalam variasi cell line serangga
3. Mencari wadah dan cell line
serangga yang paling baik untuk
dikulturkan
Bagian A

ANALISIS PERTUMBUHAN VARIASI

WADAH KULTUR
WADAH YANG DIGUNAKAN

Tubespin Bioreactor
2 Labu Erlenmeyer flask
50 (Cat. No. 87050, Botol 250 ml (Cat. No.
250 ml (Cat. No.
TPPT Techno Plastic 100389, VITLAB)
431144, Corning)
Product)
SEL YANG DIGUNAKAN

Sf21 karena sel-sel ini dianggap lebih rentan (sensitif

terhadap kondisi) daripada Sf9
PROSEDUR
Sel dikultur di medium Setelah 48 jam, ketika Kultur didistribusi di 4
Sf900III 200 ml fase mid-log (3 x 106 variasi wadah dan
dengan densitas awal sel/ml), 160 ml kultur diinkubasi pada suhu
0,8 x 106 sel/ml. awal diencer dengan 27C
440 ml medium

Sf900III
PERTUMBUHAN DI 4 VARIASI WADAH
No Volume nominal Volume kultur Rasio (V1:V2) Kecepatan Diameter
wadah (V1) (V2) goncangan goncangan
(rpm) (mm)
Labu Erlenmeyer 250
a. 50 ml 5:1 90 50
mla
Labu Erlenmeyer 250
b. 250 ml 1:1 230 25
ml
c. Botol 250 ml 250 ml 1:1 230 25
d. TubeSpin 50 ml 30 ml 1,7:1 230 25
Kondisi a merupakan kondisi standar untuk pertumbuhan sel serangga
230 rpm dengan diameter goncangan 25 mm merupakan kondisi yang
optimum untuk melakukan pertumbuhan
 Diukur selama 7 hari
HASIL Parameter: jumlah total,
kelangsungan hidup, dan
diameter
Tidak ada perbedaan
yang signifikan dalam
semua kondisi hingga 72
jam pertama
48-72 jam pertumbuhan
merupakan masa yang
penting dalam hal
pemeliharaan sel dan
ekspresi protein heterolog
KESIMPULAN BAGIAN A
Tubespin, botol, dan labu erlenmeyer yang
digunakan di percobaan ini dapat digunakan
sebagai wadah kultur sel serangga
Labu Erlenmeyer kecil dapat digunakan untuk
kultur berlebih (volumenya lebih besar
dibanding standar)
Bagian B

ANALISIS PERTUMBUHAN VARIASI

CELL LINE
CELL LINE YANG DIGUNAKAN

Sf21 Sf9 (kloning

Sf21)

Sel berasal dari ovarium Spodoptera frugiperda

Digunakan untuk produksi protein rekombinan
menggunakan baculovirus
WADAH YANG DIGUNAKAN

Tubespin Bioreactor 50
Botol 250 ml (Cat. No.
(Cat. No. 87050, TPPT
100389, VITLAB)
Techno Plastic Product)
PROSEDUR
1. Kultur awal Sf9 dan Sf21 dalam medium Sf900III disiapkan
2. Kultur diencerkan ke 0,8 106 sel/ml. 300 ml kultur encer disiapkan untuk
dikeluarkan 250 ml di botol dan 30 ml di TubeSpin.
3. Kultur diinkubasi pada 27C dengan 230 rpm.
4. Parameter dari sel yang meliputi jumlah sel, jumlah sel yang layak, viabilitas,
dan diameter sel diukur dengan Vi-Cellat dalam jangka waktu yang berbeda
dalam satu hari.
5. Ketika jumlah sel mendekati 10 106 sel per ml, sebagian dari kulturnya
diambil dan diencerkan kembali ke ~0,8 106 sel/ml. 250 ml dari kultur encer
dikeluarkan di botol baru dan di 30 ml TubeSpin. Langkah ini dilakukan 4 kali
dalam setiap percobaan
6. Pola pertumbuhan dipantau selama 600 jam (25 hari).
HASIL
Pertumbuhan dari sel Sf9
(a) dan Sf21 (b) di botol
dan TubeSpin

Kesimpulan:
Kloning Sf9 memiliki perilaku
pertumbuhan yang sama dengan
induknya (Sf21)
CATATAN
Pemantauan dilakukan dengan melihat jumlah sel hidup, diameter
sel, distribusi seragam sel, bentuk gumpalan, dan bentuk granular.
Pemantauan dilakukan dengan Vi-Cell counter atau mikroskop
Selalu periksa pertumbuhan sel setiap 6-8 jam atau semalam setelah
pengenceran untuk memastikan telah mengikuti pertumbuhan normal
Agar resiko kontaminasi terminimalisir, kultur dimulai di wadah yang
sama dengan pengenceran sampai volume tercapai
Kecepatan goncangan disesuaikan dengan volume untuk
menghindari pembentukan busa
 PROSPEK
PEMANFAAT-
AN KULTUR SEL
SERANGGA

1. Studi tentang serangga

pengembangan sel lini serangga (S9, S21, Hi5, Tn5, dan lain-lain)
mengetahui morfologi dan fisiologi serangga, struktur genetik, metabolisme,
migrasi serangga dan lain-lain.
2. Penelitian tentang virus dan diagnosis penyakit
serangga mudah menjadi vektor atau host bagi virus dan rekombinan virus. Hal ini
karena tingkat ekspresi gen asing di serangga sangat tinggi dibandingkan dengan
kebanyakan mamalia dan beberapa sistem sel mikroba. Selain itu, ada banyak virus
yang hidup secara spesifik pada spesies serangga tertentu. Sebagai host dalam
rekayasa virus
 PROSPEK
PEMANFAAT-
AN KULTUR SEL
SERANGGA

3. Pembuatan obat dan vaksin

Baculovirus Expression Vector System (BEV) Mengekspresikan Glikoprotein
rekombinan
Vektor dalam Adeno-associated Virus (AAV) Terapi Gen
Pestisida pertanian (Insektisida) virus bioinsektisidal
4. Pengembangan makanan berprotein tinggi (Human Food)
Serangga dapat menjadi salah satu pilihan asupan makanan dengan nutrisi yang
tinggi, seperti protein, zat besi, karbohidrat, dll. Tetapi, pengembangan serangga
sebagai makanan masih menjadi kontroversi.
 DAFTAR PUSTAKA
Jurnal Utama:
Rieffel S. et al. (2014). Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX, 1, 155-161.

Referensi Tambahan:
Anonim. (2002). Sf9 Cells. http://wolfson.huji.ac.il/expression/insect/ SF9%20cells.pdf, diunduh pada 24 September 2015.
Baumann A., et al. (2015). Selection and Evaluation of Tissue Specific Reference Genes in Lucilia sericata during an Immune
Challenge. http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0135093, diakses pada 24 September 2015.
Beckert A., et al. (2015). Two c-type lysozymes boost the innate immune system of the invasive ladybird Harmonia axyridis.
Developmental & Comparative Immunology, 49 (2) , 303-312.
Betting, David J.; Mu, Xi Y.; Kafi, Kamran; McDonnel, Desmond; Rosas, Francisco; Gold, Daniel P.; Timmerman, John M. (2009).
Enhanced immune stimulation by a therapeutic lymphoma tumor antigen vaccine produced in insect cells involves
mannose receptor targeting to antigen presenting cells. Vaccine 27 (2): 2509
Bhandari DR, Schott M, Rmpp A, Vilcinskas A, Spengler B. (2015). Metabolite localization by atmospheric pressure high-
resolution scanning microprobe matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging in whole-body
sections and individual organs of the rove beetle Paederus riparius. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407 (8) , 2189-
2201.
Borror et al. (2005). Study of Insect. Ed-7. Amerika: Thomson Brook/Cole.
Goosen, M. F. A., Daugulis A. J., & Faulkner, P. (1993). Insect Cell Culture Engineering. New York: Marcel Dekker, Inc.
Mlcek, Jiri, et al. (2014). A Comprehensive Look at the Possibilities of Edible Insects as Food in Europe a Review. Pol. J. Food
Nutr. Sci., 2014, Vol. 64, No. 3, pp. 147-157.
Van Oers, M. M. & Lynn, D. E. (2010). Insect Cell Culture. http://www.els.net/WileyCDA/ ElsArticle/refId-a0002574.html,
diakses pada 24 September 2015.
Yen, A. L. (n.d.). Edible insects and other invertebrates in Australia: future prospects.
http://www.fao.org/docrep/013/i1380e/i1380e01.pdf, diunduh pada 24 September 2015.