Nama Kelompok:

Aprilia Ghozirotul Maghfiroh P27834015024

Achmad Thoriq Romahon P27834015025
Dwi Pratiwi P278340150
Ni Made Widiandari A. S. P278340150
IMUNOELEKTROFORENSIS
 Elektroforesis
teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik.
Medan listrik dialirkan pada
suatu medium yang
mengandung sampel yang
akan dipisahkan. dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli
kimia Swedia Arne Tiselius untuk
pemisahan protein. Sekarang telah
meluas ke banyak pemisahan kelas yang
berbeda lain dari biomolekul termasuk
asam nukleat, karbohidrat dan asam
amino.
 Teknik elektroforensis dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium
Kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan
terhadap massanya dan bentuk molekulnya
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang
terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati
dan kondisi elektris lingkungan:
 Fe = qE
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang
dibawa oleh objek, E adalah medan
listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan
untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA.
 Jenis-Jenis Elektroforesis dan Cara
Kerja
1. Elektroforesis Kertas

Tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui
mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan
nukleosida 2-monoposfat dan 3-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang
dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida siklik
yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate
posfat siklik. Peralatan itu dinamakan elektroforesis, yang dibuat dari kertas saring Whatman
nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah
terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat
elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi
komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang
belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2-monoposfat dan
nukleosida 3-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas
saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut
terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis
yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan
partikel yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi
akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
system pemisahan. Pergerakan partikel dalam
kertas tergantung pada muatan atau valensi zat
terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion,
pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.
 2. Elektroforesis Gel Kanji

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan

biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies
mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji
dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum
manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke
dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut
akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan
sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring
Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang
diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan
bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih
baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan
elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya
menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
 Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan
disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan
gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel
Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses
polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini
sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau
protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi
elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata
teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk
memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar,
misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom
tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka
berbeda-beda.
 Adapun prosedur kerja dalam melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa sebagai berikut :

Bahan dan Alat

DNA marker, misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII

Sampel DNA, misalnya :
DNA kromosom bakteri,
DNA plasmid hasil isolasi (uncut)
DNA plasmid hasil restriksi (cut)
Agarosa
Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
Akuades
Gelas Ukur 1000 ml
Labu Erlenmeyer 50 ml
Tabung mikrosentrifuga
Sarung tangan
Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
Kertas parafilm
seperangkat alat elektroforesis
Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)
larutan Etidium Bromid (EtBr)
UV transluminator
Kaca mata UV
kamera digital
 Cara Kerja

Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.
Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan
hingga larut sempurna.
Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-
masing ujung baki)
Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki
Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 l
etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).
Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang
padat.
ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam
seluruhnya dalam TAE).
siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
masukkan 10 l sampel DNA dan 2 l loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih
dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika
tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada
sumber arus.
jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah
baki dari tangki elektroforesis.
keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
 Hasil

Pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing
fragmen/pita dengan membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker. Metode ini didasarkan pada
pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil, di bawah pengaruh medan listrik. Media
yang umum digunakan adalah sel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan
elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertical. Elektroforesis poliakrilamid
biasanya digunakan untuk menentukan DNA (sekuensing).

Larutan yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan
diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA
akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA.
Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan
bermigrasi lebih cepat dibandingkan yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen
DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan
masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lammpu UV.
Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar.

Karena pita-pita atau puncak-puncak protein terlalu rapat cenderung saling tumpah-tindih, metode pemisahan
satu dimensi, seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS atau kromatografi, hanya mampu menguraikan protein
dalam jumlah yang relatif kecil (umumnya kurang dari 50). Sehingga digunakan elektroforesis gel dua dimensi
yang menggabungkan dua prosedur pemisahan yang berbeda. metode ini dapat menguraikan lebih dari 1000
macam protein melalui pemetaan dua dimensi.
 3. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide cerdasnya untuk

memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang
dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan
pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik
PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping
berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.

Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya

dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit
dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu
tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti
akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula
membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis
selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun
sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini.
 Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam
berbagai bidang, misalnya :

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk

pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik
khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi
dalam mengungkap sebuah kasus.
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis
merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan
keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada
sebuah DNA.