Produksi dan pemurnian ekstrak

seluler D-xilose Isomerase dari

Bacillus sp. Alkalifilik termofilik
 Isomerase D-Xilosa (D-xilosa ketol isomerase, EC
5.3.1.5) disebut juga sebagai glukosa isomerase.
Xilosa isomerase mengkatalisis isomerisasi reversibel
D-xilosa menjadi D-xilulosa dan mengkatalisis
isomerisasi D-glukosa menjadi D-fruktosa.
Bacillus sp. yang memproduksi D-xilose isomerase
diisolasi dari sampel tanah sumber mata air panas
di daerah Vajreshwari, Distrik Thane, Bombay,India
 Bacillus sp. Termofilik alkalifik memproduksi xilosa
isomerase secara ekstraseluler pada pH 10 dan suhu 50C
dengan menggunakan xilosa atau gandum sebagai sumber
karbon.
Enzim dimurnikan dengan pengendapan menggunakan
amonium sulfat yang diikuti dengan gel filtrasi preparatif
poliakrilamida elektroforesis dan kromatografi penukar ion.
 Penumbuhan Mikroba
BacillusSp. ditumbuhkan pada media dasar
Media dasar ekstrak ragi 0,5%, 0,5% pepton, 0,1%
K2HPO4, 1% Na2CO3, 0,01%, MnCl2.4H20, 0,005%
CoS04 .7H20, dan D-xilosa (1%), Xylan (1%), glukosa
(1%), sorbitol (1%), natrium karbonat steril yang
ditambahkan secara terpisah untuk mengatur pH.
Bakteri ditanam dalam labu 250 ml dengan 50 ml
media cair pada suhu 50C dan pH 10 selama 16
jam pada rotasi Shaker (250 rpm).
Inokulum (10%) ditanam selama 6 jam pada media
yang sama.
 Produksi Enzim Kasar
Sel dipisahkan dari
kaldu kultur 50 ml
dengan sentrifugasi
cairan supernatan Pelet diicuci dengan
(10.000 x g, 10 menit), buffer kalium fosfat 50
sebagai ekstrak enzim
kasar ekstraselular mM pH 7.0 sebanyak 2x,
ditambah buffer 5 mL
untuk mengendapkan

dihasilkan
Sel disonifikasi
supernatan yang disentrifugasi pada 13.000 x (sonikator ionik)
disebut sebagai g selama 15 menit pada selama 2,5 menit (30
suhu 40C detik sebanyak 5
ekstrak kasar kali)
intraselular
Pengujian Aktivitas Enzim
Aktivitas D-glukosa isomerase di ukur dengan
menguji D-fruktosa yang dihasilkan
menggunakan metode sistein karbazol.
Xilanase diuji dengan mencampur enzim
dengan 0,5 ml larutan kayu muda xylan pada
volume akhir 1 ml dan diinkubasi pada suhu
50 C selama 30 menit. Gula pereduksi yang
dilepaskan ditentukan dengan metode
dinitrosalisiklik.
Protein diukur dengan metode Bradford BSA
sebagai standar
 Pemurnian Protein
Protein dalam kaldu kultur
Kultur kaldu dipanaskan
diendapkan dengan
pada suhu 60 C selama
amonium sulfat pada
10 menit.
saturasi 90%.

Perparasi elektroforesis gel

poliakrilamida (PAGE) Disentrifugasi (13.000 x g, 20
dilakukan pada pH 8.9 menit) untuk menghasilkan
dalam tabung gelas (50 endapan yang kemudian di
sampai 150 mm) dan suhu larutkan dengan buffer
4C selama 16 jam potasium fosfat 0,05 M, pH 7.0
dengan arus 20 mA dan
200 V.
 Pemurnian Protein
15 mg Protein
dimurnikan dengan
adsorpsi pada DEAE-
selulosa secara bacth
Elusi dilakukan dalam buffer
fosfat pH 7 yang
mengandung 0,2 M NaCl.
Pola protein diperiksa
dengan menodai strip
lainnya dengan Coomassie
biru cemerlang G-250.
Xilosa isomerase
dimurnikan dengan
Sodium dodecyl
sulfate (SDS) -PAGE
- Pemurnian sesuai dengan
metode Laemmli dengan
gel poliakrilamida 10%.
- Berat molekul marker
menggunakan serum
albumin bovine,
ovalbumin dan tripsinogen