H.

FREDY ZEGARRA ARAGON

 QUE ES LA
APOPTOSIS?
Por qu se dice que es una muerte
celular programada ?
 IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS
a) Mantencin de un nmero constante de clulas, mediante la
eliminacin de las redundantes (tejidos sujetos a un activo recambio
celular: hgado, mdula sea y mucosa del tracto digestivo ), permite un balance
entre proliferacin y muerte celular

b) Eliminacin de clulas potencialmente peligrosas. ( que pueden

desarrollar un proceso maligno.)
c) Funcin inmune: interviniendo en los mecanismos de defensa
especialmente en infecciones virales (donde clulas infectadas sufren apoptosis
inducida por linfocitos evitando la replicacin viral y por lo tanto la propagacin
de la infeccin.)

d) Remodelacin de tejidos embrionarios y organognesis:

Durante la gestacin se produce un exceso de neuronas : 50% son eliminadas
por apoptosis, quedando el resto para constituir el SNC.
La apoptosis tambin participa en la involucin de rganos como el timo en la
pubertad, cambios celulares que inician la menstruacin y en las glndulas
mamarias cuando termina la lactancia
 Clula
sana
APOPTOSIS

Injuria

Errores genticos
resultado de la
injuria
La clula intenta
reparar errores Todos los errores
reparados

La clula programa su
muerte va Apoptosis
Injuria
adicional
Algunos errores
permanecen

Clula incapaz de
reparar errores
TABLA N 1.- Diferencias entre los cambios morfolgicos que
ocurren en la necrosis celular y la apoptosis celular

NECROSIS APOPTOSIS
Clula hinchada Clula encogida
Orgnulos daados Orgnulos no daados
Cromatina alterada Cromatina marginada
Clula lisada Cuerpos apoptticos
Orgnulos destruidos Orgnulos intactos
Cromatina destruida Cromatina fragmentada
Contenido celular liberado Contenido celular retenido
Inflamacin Fagocitosis
Fagocitosis No inflamacin
 CARACTERISTICA NECROSIS APOPTOSIS
Participacin Celular Pasiva, carente de control gentico Activa, controlado por un programa gentico
Volumen celular Aumenta Se reduce
Cromatina Nuclear Condensacin laxa y localizacin difusa Condensacin compacta con marginizacin
nuclear
Nucleo Fragmentado Fragmentado
ADN Fragmentacin irregular , patrn de Fragmentacin internucleosomal, patrn de
barrido escalera
ARN Ribosomal Degradacin irregular Fragmentacin regular, aparicin de bandas
especficas
Orgnulos Se hinchan y tienden a fusionarse con Permanecen ntegros y no se fusionan con
lisosomas lisosomas
Membrana celular Conserva asimetra de fosfolpidos y se Aparicin de fosfatidil serina en la lmina
pierde la integridad extracelular y se conserva la impermeabilidad
Citoesqueleto Se desorganiza Conserva su estructura
Citoplasma Se vierte al espacio intersticial Se conserva en los cuerpos apoptticos
Activacin de proteasas Inespecfica y asociada a disfuncin Especfica de la familia de las caspasas
lisosomal
Estrs Oxidativo Presente slo en etapas tardas Presente desde etapas tempranas
Metabolismo lipdico Activacin inespecfica de fosfolipasas Produccin de Ac. Araquidnico , Ceramida y
sus metabolitos derivados
Reaccin infamatoria Presente Ausente
Cicatrizacin Presente a menudo con fibrosis Ausente
 Deshidratacin Celular Cuerpos Apoptticos

APOPTOSIS

Condensacin de la
cromatina Preservacin de la
integridad de la
Fragmentacin Nuclear membrana

Ruptura de la membrana
Hinchamiento de clula plasmtica
y mitocondrias

NECROSIS
 TABLA I. ALGUNOS FACTORES MODULADORES DE LA
APOPTOSIS.
FACTORES EXTERNOS
A) Estimulantes de las apoptosis
Radiaciones ionizantes, radicales reactivos de oxgeno (ROS),
Lipoprotenas de baja densidad oxidadas.
Drogas citotxicas (agentes alquilantes, antimetabolitos, antagonistas hormonales,
glucocorticoides, ciclosporina A).
Citocinas (TNF, TGF-b, IL-1b).
Receptores transmembrana (receptor Fas/APO, rTNF, rNGF, rIFN-g).
B) Supresores de la apoptosis
Factores trficos de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-6, CSF, EGF).
FACTORES GENTICOS
A) Genes estimulantes de apoptosis:
ced-3, ced-4 (C. elegans), p53, lpr, Bax (mamferos), Bcl-xS, cmyc.
B) Genes supresores de apoptosis:
ced-9 (C. elegans), Bcl-2 (mamferos), Bcl-xL.
COMPONENTES PRINCIPALES DE LA APOPTOSIS
( PROTEINAS INVOLUCRADAS EN LA APOPTOSIS)

PROTEINAS ADAPTADORAS : FADD, TRADD, TRAF, RAIDD

PROTEINAS EFECTORAS :: Caspasas

aa aa aa aa aspartato aa aa aa aa aa .

PROTEINAS REGULADORAS :: Familia Bcl-2

 CASPASAS SEGN SU FUNCIN
Inflamatorias: Participan en la maduracin de
citoquinas, como IL-1 e interfern (caspasas 1,4, y 5).

Efectoras: Participan en la degradacin de sustratos

apoptticos (caspasa 3 CPP32, caspasas 7 y 2 y CED-3).

Reguladoras: (caspasas 6 y 9 y caspasa 8, FLICE),

activan a las caspasas efectoras.
 TABLA 2.- Protenas sustrato (blanco) de las caspasas
Protena blanco Sitio de Caspasa Funcin de la protena blanco
hidrlisis
PARP1 DEDY-G 3y7 Reparacin del ADN

UI-70 Kda2 DGPD-G 3 Procesamiento del ARN

DNA-PKCS3 DEVD-N 3 Reparacin de brechas en el ADN de doble cadena

SREBP DEPD-S 3y7 Protena que se une a elemento regulado por esterol

D4-GDI DELD-S 3 Regulador de Rho (GTPasa)

PKC-d DMQD-N 3 Degradado a su forma activa en apoptosis

Pro-IL1 YVHD-A 1 Degrada a citocina activa

C1 y C24 ? 3y7 Procesamiento del pre-ARNm (HnRNA)

Laminina A y B VEID-N 6 Mantenimiento de la forma de la membrana nuclear

Gas2 SRVD-G ? Componente del sistema microfilamento

Fodrina DETD-S ? Estructura del citoesqueleto asociado a membrana

Actina G LVVD-N ? Estructura del citoesqueleto

NuMa ? ? Mantiene la estructura nuclear

1Poli (ADP-Ribosa) Polimerasa 2Pequea ribonucleoprotena de de 70 Kda 3Protena Kinasa ADN dependiente
4Protenaheteroribonuclear

D(asp), E(glu), G(gli), H(his), I(Ile), L(leu), M(met), N(Asn), P(Pro), Q(gli), R(Arg), S(Ser), T(Thr), V(val), Y(Tyr).
 Nombre Dominios Anclaje a Funcin
membrana

Subfamilia Bcl-2
Bcl-2 BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapopttica

Bcl-x1 BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapopttica

Bcl-w BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapopttica

Mcl-1 BH3, BH1, BH2 Si Antiapopttica

A1 BH1, BH2 No Antiapopttica

TABLA 2.- Clasificacin Subfamilia Bax

de los miembros de la Bax BH3, BH1, BH2 Si Proapopttica
familia Bcl-2
Bak BH3, BH1, BH2 Si Proapopttica

Bok BH3, BH1, BH2 Si Proapopttica

Subfamilia BH3
Bik BH3 Si Proapopttica

Blk BH3 Si Proapopttica

Hrk BH3 Si Proapopttica

BNIP3 BH3 Si Proapopttica

Bim L BH3 Si Proapopttica

Tomado de Adams y Cori,
Bad BH3 No Proapopttica
1998
Bid BH3 No Proapopttica
 FASE DE ACTIVACION FASE DE EJECUCION

Activacin de Activacin de Produccin de estrs Activacin de

Receptores TNF-I, Caspasas 8, 10 y 1. oxidativo. Caspasas 3, 6 y 7.
APO/FAS o CD40
Produccin de cido Cada transitoria del Participacin de
araquidnico y potencial de membrana bax y Ced-4
ceramida mitocondrial.
Membrana celular Liberacin del Cit C.

Receptor

M I T O CO N D R I A
MUERTE
CELULAR
Ligando
Bloqueo por Bloqueo por
cerpinas Bcl-2
MEDIO (crm-A)
EXTRACELULAR
CITOPLASMA

Representacin esquemtica de las fases de activacin y ejecucin durante la muerte por apoptosis
. La activacin del receptor de muerte como el receptor de TNF tipo I, el antgeno APO/FAS o el CD40,
encienden el programa de muerte. La activacin de caspasas tanto en la fase de activacin como de
ejecucin , amplifican el proceso antes y despus de la induccin de cambios en el funcionamiento
mitocondrial. Cada fase va acompaada de cambios bioqumicos que participan en la muerte celular.
AUSENCIA DE FACTOR TRFICO: Receptor de
Activacin de Caspasas Factor Trfico
Membrana citoplasmtica

Corte se sustratos MUERTE

PI-3 K Procaspasa-3 Caspasa-3

12-3-3

Akt-Kinasa Caspasa-9
CITOSOL
Procaspasa-9
Membrana
Apaf 1 Cit C Mitocondrial
Externa
Bad

Cit C Espacio
Cit C Intermambrana
Iones

Cit C
 LA FALTA DE
FACTORES TRFICOS
PROMUEVE LA
ACTIVACIN DE LAS
CASPASAS

Figure 23-50. Current models of the

intracellular pathways leading to cell death
by apoptosis or to trophic factormediated
cell survival in mammalian cells. The details
of these pathways in any given cell type are not
yet known. (a) In the absence of a trophic
factor. Bad, a soluble pro-apoptotic protein,
binds to the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and
Bcl-xl, which are inserted into the mitochondrial
membrane. Bad binding prevents the anti-
apoptotic proteins from interacting with Bax, a
membrane-bound pro-apoptotic protein. As a
consequence, Bax forms homo-oligomeric
channels in the membrane that mediate ion
flux. Through an as-yet unknown mechanism,
this leads to the release of cytochrome c from
the space between the inner and outer
mitochondrial membrane. Cytochrome c then
binds to the adapter protein Apaf-1, which in
turn promotes a caspase cascade leading to
cell death.
 Receptor de
PRESENCIA DE FACTOR TRFICO: Factor Trfico
Factor Trfico
Inhibicin de la activacin de
Caspasas
Membrana citoplasmtica

PI-3 K
Procaspasa-3
12-3-3
ATP Akt-Kinasa

P ADP
CITOSOL
Bad
Procaspasa-9
Membrana
Apaf 1 Mitocondrial
Externa

Cit C Espacio
Intermambrana

Cit C
LA PRESENCIA DE
FACTORES
TRFICOS INHIBE
LA APOPTOSIS

Figure 23-50. (b) In the presence

of a trophic factor such as NGF. In
some cells, binding of trophic
factors stimulates PI-3 kinase
activity, leading to activation of the
downstream kinase Akt, which
phosphorylates Bad.
Phosphorylated Bad then forms a
complex with the 14 - 3 - 3 protein.
With Bad sequestered in the
cytosol, the antiapoptotic Bcl-2/Bcl-
xl proteins can inhibit the activity of
Bax, thereby preventing the release
of cytochrome c and activation of
the caspase cascade. [Adapted
from B. Pettman and C. E.
Henderson, 1998, Neuron 20:633.]
(Fuente: Lodish et al., 2000)
 Toxinas, hormonas, Factores de
crecimiento, citoquinas, oxido
ntrico, etc
TNF

TNFR
RAID
RAIDD TRAF
TRADD
FADD
p50
IkB
p65
Caspasa-2
Activacin de
esfingomielinasa
Bcl-2 p50
CERAMIDA p65
Caspasas
Efectoras Supervivencia
JNK/SAPK NF-kB celular
Caspasa-3 Endonucleasas

Caspasa-6
Caspasa-7 APOPTOSIS
Fragmentacin del ADN

FIGURA N 1. Apoptosis inducida por Factor de Necrosis Tumoral

 Fas L

Fas

Smac/Diablo IAP
FLIP FADD
Pro-Caspasa 8

Pro-
Caspasa-3 p18
p11 Cit C Apoptosoma
p11
FIGURA N 2. p18 Pro-
Cit C
Bcl-XL Caspasa -9
Apoptosis inducida Caspasa-8
APAF - 1
Bid
por Fas Pro-
Caspasa -9 Cit C
Caspasa-3 dATP
Caspasa
9

Caspasas Caspasa-3
Efectoras
Caspasa-6
Caspasa-7
APOPTOSIS
 Clula Efectora Citoltica
(lifocitos T citotxicos, y NK)

Degranulacin Granzima B
Ca2+ Ca2+
Ca2+ Perforina

Pro-
Caspasa-3

Liberacin de
Granzima B
Citocromo C
C A C A

I CAD D Caspasa-3
I

APOPTOSIS Clula tumoral

o
HMG1 Topo II infectada por
HMG2 virus

APOPTOSIS
Fragmentacin del DNA

FIGURA N Induccin de apoptosis por Granzima A

ADN Luz UV
Luz UV
Radiacin MITOCONDRIA
Radiacin
Stress
Quimioterapia

?
Cit C

Complejo del Poro

Complejo del Poro
de Permeabilidad
de transicional:
Permeabilidad
transicional:
ANT, VDAC Pro-
ANT, VDAC Caspasa-9 Cit C
transportador de canal de aniones
nuclotidos de dependiente de Cit C APAF - 1
adenina voltaje
Pro-
Caspasa-9
Cit C
Daos Redox de dATP
desintoxicacin
Drogas / Xenobiticos

Caspasa 9
APOPTOSIS

Figura N Va Intrnseca de la Apoptosis

 Luz UV Agentes
Reparacin del ADN qumicos Transcripcin del gen IGF-BP3.
daado Inhibe seales antiapoptticas

(1)

p53 (4)
GADD45 (3) (2)
Transcripcin del gen Bax.
Activa la apoptosis

Transcripcin del gen GADD45 Transcripcin del gen p21

CkL
E2F
(-)
Complejo Ciclina / CdK

Bloqueo de la progresin del CdK

Rb
Ciclo Celular

Figura N . p53 y detencin del Ciclo Celular. Mecanismos que reconocen el ADN daado, detienen la degradacin de p53 y modifican a la
protena p53. (1). P53 estimula la transcripcin de p21 (2) y GADD45 (3). El producto de p21 inhibe el complejo Ciclina / CDK, lo cual evita la
fosforilacin de Rb (Retinoblastoma) la cual continua para inhibir el Factor de transcripcin E2F, bloqueando por lo tanto la progresin celular a
travs del Ciclo Celular (evitando que entre a la Fase S). p53, tambin estimula la transcripcin del gen GADD45 (Grow Arrest and DNA
Damage) que cofifica para una enzima reparadora del ADN. Si el dao no es reparado, los genes apoptticos son activados (4).
Ligando de Drogas
Deprivacin de DNA daado
muerte Citotxicas
citoquinas
Ej. FasL
p53
Protenas BH3
solamente
Receptor de
muerte
Ej. Fas Pro-sobrevivencia
Miembros de la familia Bcl-2

Adaptadores Bax/Bak

FADD Activacin de caspasas Dao mitocondrial

iniciadoras
Liberacin de
Activacin de citocromo c
caspasa 8
Apaf-1
Activacin de
caspasas
efectoras Activacin
de Smac/
caspasa 9 Diablo
FLIP
Protelisis de protenas
FIGURA N vitales IAPs

APOPTOSIS
 ENFERMEDAD
Por inhibicin de apoptosis
Cncer
Colorrectal Neuroblastoma
Glioma Leucemias y linfomas
Hgado Prstata
Enfermedades Autoinmunes
Miastenia grave
Lupus eritematoso sistmico
Enfermedades inflamatorias
Asma bronquial
Enfermedad inflamatoria intestinal
Inflamacin pulmonar
TABLA N 6. 4.- Enfermedades Infecciones vricas
asociadas a apoptosis Adenovirus
Baculovirus
Tomado de Ramrez Chamond R. y col. Por Exceso de Apoptosis
Sida
Linfocitos T
Enfermedades neurodegenerativas
Enfermedad de Alzheimer Retinitis pigmentosa
Esclerosis lateral amiotrofica Epilepsia
Enfermedad de Parkinson
Enfermedades hematolgicas
Anemia aplasica Linfocitopenia T CD4+
Sndrome mielodisplasico Deficiencia de G6PD
Dao Tisular
Infarto de miocardio Dao isqumico renal
Accidente cerebrovascular Rin poliquistico
TABLA N 6.5. Tcnicas utilizadas para la determinacin de apoptosis
METODO DESCRIPCION
Microscopia ptica y electrnica Cambios morfolgicos: Condensacin de la
cromatina, encogimiento citoplasmtico, etc.
Electroforesis del DNA en geles de Se observa el patrn en escalera del DNA degradado.
agarosa.
Citometria de flujo
Cambios en el ncleo
TUNEL Adicin enzimtica de nucletidos marcados con
fragmentos de ADN de doble hebra.
Ioduro de propidio Entra en las clulas por un aumento de la
permeabilidad de la membrana.
Hoescht 33342 Entra en todas las clulas. Tie el ncleo y permite
observar la condensacin de la cromatina
Cambios en la membrana
Anexina V Tiene una alta afinidad por la fosfatidil serina en la
superficie celular
PRINCIPALES TECNICAS USADAS PARA LA DETECCIN DE APOPTOSIS
TECNICA DESCRIPCION
Microscopa ptica y Cambios morfolgicos (condensacin cromatnica,
electrnica encogimiento citoplasdmtico
Electroforesis del ADN Patrn en escalera de ADN degradado en uno o mltiples
nucleosomas.
TUNEL Adicin enzimtica TdT de nucletidos marcados en
fragmentos de ADN de una doble hebra.
ISNT Adicin enzimtica (ADN Polimerasa I de nucletidos
marcados en fragmentos de ADN de una sola hebra.
Tincin con Yoduro de Entra en la clula con aumento de la permeabilidad de la
propidio membrana (clulas necrticas y fases tardas de la
apoptosis).
Hoescht 33342 Entra en todas las clulas y tie el ncleo permitiendo
observar una condensacin cromatnica
Anexina V-FITC Detecta fosfatidil serina en la superficie celular para la cual
tiene gran afinidad la anexina