Rapid Isolation of Antibody from a

Synthetic Human Antibody Library by

Repeated Fluorescence-Activated
Cell Sorting (FACS)

Oleh:
A.Yuli Rohma NIM: P1505216006
Halima Hatapayo NIM: P1505216004

Mata Kuliah : Imunologi, Biomedik -Kimia Klinik

 Introduction

Dalam 2 dekade terakhir

ANTIBODI

Penggunaanya
Terapi & Agen diagnostik Teknologi
Hibridoma

Isolasi
(Antibody Spesifik)
Teknologi
High-throughput
screning
Masalah
Munculnya virus baru dan cepatnya penyebaran virus yang
menyebabkan penyakit serius pada manusia dan hewan telah
menimbulkan kekhawatiran dunia

Jenis Virus
SARS coronavirus, virus flu babi H1N1, dan Virus flu burung
H5N1

Langkah antisipasi
pengembangan sarana baru untuk segera mengisolasi
antibodi untuk melawan penyebaran infeksi virus yang cepat
sangat dibutuhkan baik pada pengobatan maupun diagnosis
awal.

Dibutuhkan metode isoalasi antibodi yang cepat

Teknologi Hibridoma

New
Methode
Animal
immunization

High-throughput
screning
Isolation of B cells
from the spleen
fluorescence-activated
cell sorting (FACS)
Cultivation of
myeloma cells
require
relatively Short
require time periods
relatively long (several days)
time periods
(weeks - month
Fluorescence-activated cell sorting (FACS) telah digunakan dalam skrining
high-throughput dari huge library:

strategi / langkah-langkah untuk skrining rekombinan antibodi library

dgn FACS

Kultivasi/Budidaya sel library

1
fluorescent-antigen-peptida atau pelabelan protein dari sel
2 library;

sorting dengan FACS dari populasi highly fluorescent

3

regenerasi dari sel yang disortir dengan pertumbuhan

4 kembali atau kloning ulang dari gen target yang disortir

Pengulangan langkah i-iv sampai populasi yang sangat highly

5 fluorescent terpisah dari populasi kontrol negatif

analisis klon individual

6
Materials and Methods

Bacterial strain and growth conditions

FACS screening

Purification of the antibody fragment

 Bacterial strain and growth conditions
sebagai host utama gen kloning & skrining
Escherechia Coli
library

digunakan untuk produksi dan pemurnian

E. coli HM13
antibodi yang diisolasi (scFv)

sel E. coli tsb diinokulasi Luria-Bertani (LB) medium

Dilakukan kultifasi semalaman at 370C and 200 rpm

sel-sel dipindahkan ke 100 mL media LB diinkubasi pada 370C &

segar tanpa glukosa labu 500 mL 200 rpm

Bila kerapatan sel (OD 600) mencapai 0.6, kultivasi di 25oC pada 200
Sel diinduksi dengan 1 mM rpm selama 4 jam
isopropil--D-thiogalaktopiranosida (IPTG)

Sel-sel tersebut dipanen dengan sentrifugasi pada 6.000

rpm 10 menit disuhu 40C untuk analisis lebih lanjut.
 FACS screening
Skrining FACS dari human sintetic antibody library (scFv), tiga probe antigen
fluorescen disintesis secara kimia :
(i) FITC-CRDNWHGSNRPW epitop N1 dari H1N1 Virus influenza
(ii) FITC-NSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGG epitop PreS2 dari HBV
(iii) FITCPVTNVRGDLQVLAQK epitop VP1 dari FMDV

Hasil sentrifuge dari proses bakteri strain (proses sebelumnya) menghasilkan

pellet sel, yang kemudian dilakukan pelabelan probe fluoresen

Pelabelan probe fluoresen, pelet sel di resuspended dgn 5x Tris-KCl buffer ,

yang secara dramatis meningkatkan permeabilitas E. Coli luar membran dan
memungkinkan probe antigen fluresent meresap ke periplasma.

Sel resuspended diinkubasikan dengan 5 M peptida antigen (epitop N1,

PreS2, atau VP1) yang telah di konjugasi dengan FITC selama 1 jam pd suhu
40C. Sel-sel itu kemudian dicuci 2 kali dengan buffer yang sama (5x Tris-KCl)

Sel berlabel probe fluorescent, selanjutnya akan disortir menggunakan FASC

 Sambungan. FACS screening
Proses sorting dengan FACS Sel dipilih berdasarkan intensitas fluoresensi
yang tinggi deteksi melalui pita filter 530/40 untuk menghasilkan spektrum
emisi FITC. '' Purify mode '' digunakan sebagai sortir mode, yang hanya
menyortir tetesan yang mengandung sel positif (highly flourescent).

Semua sel E. coli yang disortir di setiap putaran pada skrining ini
segera digunakan kembali untuk sorting FACS putaran berikutnya
tanpa diregenerasi.

Sorting diulang sampai diperoleh populasi yang highly-fluorescent

dan seluruh populasi itu diperkaya/disuburkan.

Setelah proses sorting berakhir, gen scFv diamplifikasi dan dilakukan

Pemurnian Fragmen Antibody
 Purification of the antibody fragment

Sel di kultivasi, dipanen, disentrifugasi, kemudian

dicuci dgn PBS dan resuspended dalam buffer yang
sama. Ekstrak kasar dari sel-sel itu disonication dan
disentrifugasi untuk menghasilkan lysate yang
mudah larut.

Lysate yang mudah larut disaring melalui syringe filter 0,45

m, dan lisat dituangkan ke kolom kromatografi Poly-prep
diisi dengan resin logam. Resin dicuci dua kali dgn 10 mL
dari buffer pencuci,
ScFv (fragmen Ab) yang telah dimurnikan digunakan
untuk analisis ELISA.

ELISA digunakan untuk mengkonfirmasi aktivitas

pengikatan scFv melawan FMDV yang tidak aktif
Gambar 1. Diagram skematik yang menunjukkan prinsip strategi
penyortiran ulang untuk isolasi antibodi afinitas tinggi.
 Result
Dari campuran sel, dilakukan sortir sel berfluoresent, segera setelah
sortingan putaran pertama, sel hasil sorting tsb kemudian diaplikasikan
ke putaran berikutnya penyortiran dilakukan dengan FACS tanpa
regenerasi sel (4xputaran) seperti yang ditunjukkan pada gambar 2, sel
berfluoresent mulai mendominasi setelah putaran kedua dan full
dominan setelah penyortiran putaran keempat.
Hasil sorting yang didominasi oleh klon probe spesifik dengan jelas
menunjukkan strategi skrining FACS yang berulang bisa digunakan
sebagai skrining secara cepat untuk antibodi spesifik.
 Discussion
FACS Skrining
Sel dengan highly fluorescent menghasilkan calon antibodi potensial bisa
dikumpulkan dalam empat jam melalui sorting berulang.
Untuk skrining ini, kami menggunakan FACS penyortir berkecepatan tinggi yang
bisa menyaring hingga 70.000 sel per detik dan, putaran pertama dapat mensorting
0,5-1,5 juta sel dari library & memakan waktu sekitar 2 jam dan semua sortingan
berulang (4-5 kali) bisa selesai dalam waktu 4 jam

Afinitas dan spesifitas Antibodi

Afinitas/Aktivitas pengikatan (KD) antibodi hasil isolasi terhadap

masing-masing Antigen juga ditentukan oleh analisis SPR
Spesifitas Antibodi ditentukan dengan CDR, & diperoleh human library
antibodi berkualitas tinggi dengan keragaman tinggi di enam CDR
 Conclution
Sebagai kesimpulan, kami mengembangkan strategi baru untuk
mengisolasi antibodi spesifik terhadap antigen pada E. coli hanya
dengan mengulangi FACS menggunakan kecepatan tinggi.
Penyortir sel Syntetic Human Antibody Library dihasilkan
sepenuhnya dengan enam CDR yang terdiversifikasi di E. coli,
Dengan Sortir berulang, calon antibodi potensial melawan tiga
antigen virus (N1 virus influenza H1N1, PreS2 HBV, dan VP1 FMDV)
bisa berhasil diisolasi dalam satu hari. Kandidat Antibodi terisolasi
kemudian mudah dimurnikan, dan aktivitasnya setiap antigen tinggi
telah dikonfirmasi dengan melakukan ELISA
 Limitation
Sebagai satu keterbatasan, kita bisa mempertimbangkan
variabilitasnya dari kinerja skrining FACS sehubungan dengan
individu antigen. Karena sifat yang berbeda (lengket, ukuran dan
permeabilitas) dari probe antigen individu.
sel yang diperoleh bisa nonspesifik meskipun diberi label dengan
probe dan, hasil penyaringan yang tidak diinginkan (Isolasi antibodi
non-spesifik dan afinitas rendah) bisa jadi diperoleh.
Untuk meminimalkan label probe yang tidak spesifik, kita mungkin
perlu memodifikasi kondisi pelabelan dan sistem tampilan sesuai
dengan sifat probe. Misalnya, saat ini sistem display, ukuran besar
(>10 kDa) probe tidak bisa digunakan skrining karena tidak bisa
masuk ke periplasma sel,
Sehingga dpt dinyatakan strategi ini tidak sesuai untuk skrining
antibodi terhadap Antigen ukuran besar termasuk seluruh virus.
 Wassalam.

TERIMA KASIH

Maafkan atas keterbatasannya

Abstrak Antibodi dan turunannya adalah zat yang paling penting dalam terapi dan
diagnostik. Meskipun setelah adanya kemajuan tehnologi yang signifikan untuk
skrining antibodi dari huge library, masih dibutuhkan waktu yang lama untuk
mengisolasi antibodi, yang dapat menghalangi tindakan cepat dalam melawan
penyebaran penyakit. Di sini, kami melaporkan strategi baru untuk mengisolasi
antibodi yang diinginkan Dari sebuah kombinatorial library dalam satu hari dengan
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) secara berulang. Pertama, kami
membuat library dari synthetic human antibody di mana fragmen variabel rantai-
tunggal / single-chain variable fragmen (scFv) diekspresikan dalam periplasma
Escherichia Coli. Setelah melabeli sel dengan fluorescent antigen probes, sel-sel
yang memiliki fluorescent tinggi (sangat berfluorescent) disortir dengan
menggunakan high speed cell sorted, dan sel-sel ini digunakan kembali tanpa
dilakukan regenerasi pada sorting putaran berikutnya. Setelah mengulangi proses
sorting ini, Klon benar-benar positif diperkaya dalam beberapa jam. Dengan
demikian, kami menskrening library terhadap tiga antigen virus, Termasuk virus
influenza H1N1, virus Hepatitis B, dan virus penyakit kaki dan mulut. Akhirnya,
Kandidat antibodi potensial, yang menunjukkan nilai KD antara 10 sampai 100 nM
melawan antigen target, berhasil diisolasi meskipun library-nya tergolong kecil
(~106). Hasil ini menunjukkan bahwa screening dengan FACS berulang tanpa
regenerasi dari sel yang disorting dapat menjadi metode yang ampuh/baik ketika
dibutuhkan respon cepat terhadap penyebaran penyakit.