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Tcnicas en inmunologa.

Introduccin
Sistema inmune innato:
Componentes celulares:

Clulas Natural Killer (NK).

Macrfagos.

Clulas dendrticas.

Componentes Humorales:

Complemento: Ayuda a los anticuerpos y

clulas fagocticas. Abre poros.


Citoquinas: Secretadas por linfocitos y

macrfagos entre otras clulas.


Sistema inmune especfico:
Componentes celulares:
Linfocitos T.
Linfocitos B.
Componentes humorales:
Anticuerpos.

Tcnicas en inmunologa: Surgieron al


estudiar el sistema inmune de un
individuo, y comprender su
funcionamiento. Posteriormente se
extendieron a otros campos.
Anticuerpos

Son molculas denominadas


gammaglobulinas. Hay cinco clases
distintas. Su estructura consta de
cuatro cadenas iguales dos a dos, con
dos cadenas pesadas y dos cadenas
ligeras. Estn unidas por puentes
disulfuro, tanto entre las cadenas
(Intercatenarios)como entre ligera y
pesada.
Existen cinco cadenas pesadas distintas que forman los cinco
tipos de inmunoglobulinas. El nombre de cada
inmunoglobulina viene dado por su cadena pesada (Cadena gamma
Inmunoglobulina gamma (Ig G)). En
cuanto a las cadenas ligeras, solo existen dos tipos, .
Existen por tanto cinco tipos de inmunoglobulinas, y una de ellas
posee dos variantes, una de ellas con cada
uno de los tipos de cadena ligera. Esta inmunoglobulina es la Ig G.
Algunas de ellas pueden formar agrupaciones, como el caso de la Ig
G y la Ig A. Los cinco tipos de
inmunoglobulinas son:
Ig M
Ig G
Ig A
Ig D
Ig E
Son las regiones N terminales las responsables de
reconocer al antgeno. El resto, que se denomina
regin constante, es la que cumple la funcin del
anticuerpo. La regin variable cambia mucho entre
anticuerpos. Las dos cadenas tienen regin variable.
La combinacin entre la regin variable de la cadena
ligera y la de la cadena pesada constituye la regin
que reconoce el determinante antignico. Los dos
brazos de son iguales, pudiendo unir dos
determinantes antignicos iguales. Este es el
nmero de valencia de un anticuerpo (2), pero
existen dos excepciones. En elcaso de la Ig G, esta
se encuentra en pentmeros, que se forman al
unirse los anticuerpos al denominado segmento J, con
lo cual presenta una valencia potencial de 10, que suele
quedarse en seis por razones de espacio fsico a la hora
de unirse a su determinante antignico.
a

Algo similar ocurre con la Ig A, que formar


agregados por el segmento J, forma dmeros o trmeros, con
valencias potenciales de 4 y 6, respectivamente.
Los tres tipos restantes son monmeros.
Los anticuerpos no solo se encuentran solubles, sino tambin en
forma de membrana en los linfocitos B.
Cuando reconocen el antgeno se activa el linfocito, pasando a clula
plasmtica, secretora de nmunoglobulinas. Segregar el mismo
anticuerpo que tena en la membrana, excepto que pierde la
regin de anclaje a la misma.
Regla nemotcnica: GAMDE. Los anticuerpos se encuentran
circulantes. La de mayor concentracin es la G (8-10 mg/ml)
seguida de la A (1-4 mg/ml) y la M (0,5-2 mg/ml). La D se
encuentra en cantidades bajsimas (0-0,4 mg/ml) y la E es
prcticamente indetectable (10-4-10-3 mg/ml).
Los valores de las inmunoglobulinas en el suero humano son muy
similares a los de la rata o ratn, animales donde se practican
ensayos y tcnicas de posterior utilizacin en humanos.
La Ig G puede pasar a travs de la placenta. El nio tiene sus
primeras inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a
menos que se produzca una infeccin, por lo que sintetizara Ig M.
La Ig G activa la cascada del complemento por la va clsica.
La Ig A se encuentra en la mayor parte de las secreciones corporales,
y produce la activacin de la cascada del complemento por la va
alternativa.
La Ig M se encuentra circulante y se encarga de la activacin de la
cascada del complemento por la va clsica.
La Ig D se encuentra como molcula de membrana en los linfocitos B.
La Ig E, aparece en alergias e infecciones por parsitos, siendo
indetectable en situaciones normales.
La regin variable de los anticuerpos tiene tres zonas que
varan mas que el resto. Se conocen como las regiones
hipervariables o regiones determinantes de la
complementalidad. Las tres unidas son las que reconocern
el antgeno. Esto nos da la gran diversidad de anticuerpos.
Esta regin se llama idiotipo: su estructura en el espacio es
como una cerradura para un determinado antgeno. Las
fuerzas entre el anticuerpo y el determinante antignico es
un sumatorio de fuerzas, que individualmente no son fuertes.
Participan cuatro
fuerzas.
Los primeros conocimientos sobre estas fuerzas fueron
obtenidos mediante el uso de enzimas como la pepsina
o la papana, que cortan la molcula. La pepsina corta los
puentes disulfuro, dando dos zonas, los fragmentos
F(ab) y los fragmentos F(c), cristalizables.
Ventajas de los anticuerpos
en las tcnicas de
inmunologa.
La interaccin antgeno-anticuerpo es especfica,
pudiendo determinar la presencia del antgeno que
buscamos en una mezcla de cosas, sin necesidad de
purificar. Nos permiten realizar tcnica muy especficas.
Hay que saber la concentracin de lo que queremos
medir, adems de contar con el tamao de aquello que
buscamos. Tambin hay que conocer el mayor o menor
grado de especificidad, que depende de pureza de la
muestra y del anticuerpo que utilicemos. Otros factores
de diseo son los costes.
La seleccin de reactivos es importante. Podemos
determinar muchas veces el anticuerpo y el antgeno.
Hay
que conocer el grado de afinidad entre ellos.
Avidez: Es el sumatorio de fuerzas que se
establecen entre un antgeno y un anticuerpo. Una
Ig M unindose por varios brazos tendr alta
avidez aunque su afinidad sea pequea. Depende
de la afinidad y de las valencias, as como de la
estructura en el espacio.
Especificidad: Sera ideal cuando el anticuerpo solo
reconoce un determinante antignico. No siempre
es ideal.
Anticuerpo heterfilo: Se han generado frente a un
determinado organismo y son capaces de
reconocer otras cosas en otras especies distintas.
Crossreaccin: Posee reaccin cruzada. El anticuerpo
detecta otras estructuras que no debera, pero
puede llegar a ser til en las tcnicas.
Los anticuerpos deben estar en condiciones correctas,
para ello se usa el denominado buffer fisiolgico.
Podemos utilizar matrices para desarrollar las tcnicas.
A veces son semislidas, plsticas, de vidrio, etc.
Dependiendo de la tcnica a utilizar, seremos ms o
menos especficos y mas o menos concretos.
En resumen, las ventajas del uso de las tcnicas de
inmunologa son dos, la especificidad y la rapidez.
En casi todas las tcnicas de inmunologa se lleva a cabo
la lectura utilizando uno de los tres procedimientos
siguientes:
El complejo antgeno + anticuerpo posee un
comportamiento distinto: Precipitacin de
complejos y aglutinacin.
Unir cosas al anticuerpo sin que pierda si
capacidad de reconoce. Podemos pegarle
enzimas,
bombillas (Fluorescencia), sustancia
luminiscentes, sustancias radioactivas, etc.
Al antgeno podemos pegarle cosas sin que
cambie la reaccin con el anticuerpo.
Podemos pegarle las mismas cosas que a
los anticuerpos.
Temas 2-3:Tcnicas de
aglutinacin y
precipitacin.
Se basan en la propiedad de los anticuerpos de tener dos brazos. Unen
los antgenos aproximndolos en el espacio, formando complejos
insolubles. Dependiendo si es un elemento soluble o particulado,
veremos reacciones de precipitacin o aglutinacin. En una primera
fase las molculas de anticuerpo se van uniendo, y siempre que
tengan mas de un determinante antignico igual, se darn estas
tcnicas.

Necesitamos que el antgeno tenga mas de un determinante


antignico igual, para poder ser reconocido por mas de una
anticuerpo a la vez, formando redes que sean insolubles, y
precipiten en caso de las tcnicas de
Tcnicas de precipitacin
Difusin pasiva (Medio lquido)
Se pondr anticuerpo y antgeno y se
dejarn que difundan sin forzarlos. Si lo
hacemos en medio lquido se conoce
como tcnica de difusin doble.
No es una buena tcnica para cuantificar, debido
a su falta de precisin. Existen otras dos tcnicas
de difusin
pasiva, pero en lugar de utilizar medio lquido,
utilizan geles semislidos, Tambin requieren un
tiempo de incubacin.
Difusin pasiva (Medio
semislido) Ouchterlony.
El nombre se debe al creador de la tcnica. Se realiza
sobre un portaobjetos. Sobre este se coloca una
pelcula de agar, y se hacen dos pocillos. En cada uno
de esos pocillos se coloca antgeno y anticuerpo (Uno
en cada pocillo). Lo dejamos difundir 16 horas
normalmente. Si aparece entre ellos la lnea de
precipitacin, habremos identificado aquello que
buscbamos, ya sea antgeno o anticuerpo. No es
muy sensible.
Adems de la falta de sensibilidad, posee otro gran
problema, que es la gran cantidad de muestra necesaria
(En torno a microgramos), lo cual hace su uso limitado a
ciertos ensayos y utilidades.
Su utilidad es la de comparar la lnea de precipitado entre
distintos antgenos. Podemos poner mas de un pocillo en
dos pocillos y comparar ambos. Si la lnea de precipitacin
es continua, los dos antgenos son iguales. Si son distintos
tendremos dos redes de precipitado que se cruzan. Puede
detectar crossreacctividad o que alguno de los antgenos
no se reconozca por el antgeno.
Como es un mtodo cualitativo, podemos hacer diluciones
seriadas y ver donde se pierde la banda, para poder
cuantificar, pero es muy poco precisa, denominndose
semicuantitativa. Es la tcnica conocida como
Ouchterlony de difusin pasiva doble.
Difusin pasiva (Medio semislido) Inmunodifusin
radial.
Se realiza en gel. El gel est embebido en uno de los
reactivos, y hacemos un pocillo con diluciones en el
otro (Ag-Ac). Dejamos difundir mucho tiempo. El Ag
ir difundiendo, y al llegar a la zona de equivalencia
([Ac]"[Ag]) se formar precipitado. La distancia del
punto central a la lnea de precipitado es
proporcional a cantidad de Ag de la muestra. Al
compararlo con un patrn tendremos una cantidad.
Realizamos una recta patrn con las reas de las

muestras conocidas y extrapolamos a la muestra


problema.
Todas estas tcnicas de precipitacin
podemos agilizarlas en el tiempo,
pudiendo en ciertas condiciones, como
pH y corriente elctrica, forzando el
movimiento para que se vean antes.
Son tcnicas de difusin que ya no
son pasivas, y suelen utilizarse por

electroforesis.
Combinadas con
electroforesis.

En gel: Electroforesis en contracorriente. Es


como el Ouchterlony pero aplicando una
corriente elctrica. La lnea aparece en
pocas horas. A pesar de ser cualitativa
podemos hacerla semicuantitativa, pero
se hace en pocas ocasiones. Se usa poco,
pero sobre todo para diagnosticar
enfermedades autoinmunes.

En gel: Electroforesis en contracorriente. Es como el


Ouchterlony pero aplicando una corriente elctrica.
La lnea aparece en pocas horas. A pesar de ser
cualitativa podemos hacerla
semicuantitativa, pero se hace en pocas ocasiones. Se
usa poco, pero sobre todo para diagnosticar
enfermedades autoinmunes.

Tcnica de Laurell o del cohete: El gel se embebe con


uno de los reactivos, y hacemos diluciones seriadas.
Lo sometemos a electroforesis. El arco del
precipitado es como un cohete en lugar de redondo.
Es cuantitativa, comparando con una recta patrn
utilizando la longitud de los cohetes. A mayor longitud
mayor concentracin de antgeno.

Inmunoelectroforesis: Posee una utilidad concreta:


diagnstico de tumores de clulas plasmticas:
Mielomas. Aparece en personas ancianas. Tendremos
muchos anticuerpos de un solo tipo. En una
electroforesis migrarn todas en el mismo punto, en
lo lugar de lo normal. Tambin identifica el tipo de
mieloma
Se hace en medio semislido (Agar normalmente), y haremos un
pocillo con el suero del enfermo, y un suero control, sometindolo a
un campo elctrico. Cortamos el agar en esa zona entre los sueros y
se aplica anticuerpo contra Ig humana (Ig M por ejemplo). Al
encontrar la equivalencia se formar lnea de precipitados.

Para la realizacin de un diagnstico se deben poner todos los


anticuerpos frente a las inmunoglobulinas humanas.

Inmunofijacin: Es el mas utilizado en los ltimos aos. Sirve


tambin en diagnstico de mielomas, pero es ms rpido y
sencillo. Se realiza en geles de agar. Aplicamos el suero en
distintos pocillos y se somete a una electroforesis. Se
colocan plantillas para separar los carriles y aadimos a
cada canal una anticuerpo distinto, Anti Ig totales, Anti Ig M,
Anti Ig A, Anti
No se pone para D y E, porque son rarsimos
dada su baja concentracin en sangre.
porque son rarsimos dada su baja concentracin

en sangre. Rpidamente se encuentra con el


antgeno y precipita. Lo normal es un patrn
poco homogneo de anticuerpo. Si existen
mielomas habr mucha cantidad de ese
anticuerpo y encontraremos una lnea
concreta. Se dan casos de existencia de
mas de un mieloma.
Turbidometra

Antes de precipitar, el medio se pone turbio, y


midiendo esta turbidez, podemos cuantificar. Se
necesita muestra control. Para la realizacin de esta
tcnica es necesario el uso de un espectrofotmetro.
Nefelometra
Es actualmente muy utilizada. Es un mtodo directo
para medir la dispersin de la luz de forma cintica.
Se hace normalmente con lser, que incide sobre
una solucin. Se mide la desviacin de la luz a lo
largo del tiempo. Es muy rpido y cuantifica. Puede
utilizarse para medir el complemento, pero no es
demasiado sensible.
Tcnicas de aglutinacin
Se basan en los cambios de propiedades que
sufren el antgeno y el anticuerpo al formar
un complejo. Para poder darse necesitan
cumplirse una serie de caractersticas:
El anticuerpo debe poder unir por los dos
brazos al antgeno.
El antgeno deber tener mas de un
determinante antignico igual.
Los antgenos son elementos pequeos, son
partculas: bacterias, partculas de ltex,
hemates, complemento...
Aglutinacin directa

Se utilizan antgenos ya presentes en


la cubierta de las clulas. Es el caso
de la determinacin de grupos
sanguneos.
Se saca un poco de sangre, y se le
aade a tres alcuotas de esta, AcRH
un control positivo y uno negativo.
Segn la aglutinacin en cada pocillo,
tendremos el grupo sanguneo del
individuo a tipar.
Aglutinacin indirecta

Las partculas no llevan el antgeno pero se lo podemos pegar


qumicamente. Se utilizan hemates y partculas de ltex. Puede
usarse el tamino como pegamento, entre otros. Incubacin:
Hemates o ltex + antgeno
Complejo partcula-antgeno.
En el caso de los hemates tienen pegados frmacos o drogas de
forma inespecfica en la membrana, por ello
al tomar un frmaco hay personas que tienen anemia. Se utiliza para
la deteccin de anticuerpo contra
Treponema pallidum o algunos factores reumatoides.
En caso de poseer aquello que estamos buscando, se producirn
grumos. A pesar de ser una tcnica diseada
para su uso cualitativo, puede hacerse semicuantitativa mediante el
uso de diluciones. Esta tcnica es capaz de
detectar 0,001
Aglutinacin con antiinmunoglobulina.
La mejor Ig para realizar este tipo de tcnicas es la Ig
M, puesto que es la que mayor aglutinacin produce,
adems de tener un mayor nmero de brazos. Los
hemates tienen mucha carga negativa, y se repelen
si estn
muy cerca, haciendo imposible que un anticuerpo tenga un
hemate distinto en cada brazo.
Utilizando una inmunoglobulina frente a la propia inmunoglobulina G,
obtenemos una ampliacin que
permite la aglutinacin en el espacio.
Un ejemplo de utilizacin de esta tcnica es la que se realiza cuando se practica el
test de Coombs:
Los anticuerpos frente a la Ig G pasan la placenta.
En la sangre del nio hay mas anticuerpos de la madre Aadimos Ac frente a la Ig
G y se ve la
aglutinacin Test directo.

Esto ocurre cuando la madre es RH negativa y el nio RH positivo.


Se coge sangre de la madre mas hemates RH positivos, le aadimos Ac frente a
Ig G humana y vemos si hay aglutinacin Test indirecto.

La Ig G es mala aglutinante.
Reacciones de inhibicin
Es la ms sensible de todas las tcnicas de aglutinacin. Se utilizan
hemates. Ya se conoce el antgeno problema, y lo hemos
pegado a la superficie de los hemates. Lo que intentamos ver es
cuando se produce la inhibicin del proceso de aglutinacin. A
mayor cantidad de antgeno, menor capacidad de aglutinacin
voy a tener. Partimos de cantidades conocidas de antgeno y
anticuerpo, y prosigo aadiendo antgeno.
Se utiliza para ver en asesinatos o violaciones el RH o grupo
sanguneo del acusado. Esto se hace si haymuestras de semen o
saliva. Tambin puede concluirse si existen restos de drogas en
las muestras.
Existe un problema en la utilizacin de estas tcnicas, dado que los
hemates se destruyen en un perodo de tiempo muy corto. Para
solucionar este problema se intenta utilizar bolas de ltex. De
todas maneras casi todos los reconocimientos han de realizarse
con sangre fresca.
Tcnicas que utilizan el
complemento.
Estas tcnicas se crearon para poder medir el complemento de
un individuo. Para poder llevarlo a cabomedimos
componente por componente y nos fijamos si el
complemento activo forma poros en las membranas de los
hemates.
Para ello se utilizan hemates de oveja, anticuerpos de conejo
o antihemates de la propia oveja, adems del suero
problema con C1-C9. Ponemos a incubar el conjunto. Los
anticuerpos se pegarn a los hemates, activando el
complemento, que provocara poros en estos, causando la
lisis, que podemos observar.
Deben compararse con controles, y debemos fijarnos en que
cantidad hace falta para lisar el 50% de los hemates. La
cantidad de suero que hace falta para lisar el 50% de los
hemates se denomina CM50 y se utiliza como unidad de
medicin de la actividad del complemento.
Fijacin del complemento.
Existe competencia entre el control y la muestra problema
para la unin del anticuerpo y el antgeno. Hay que aadir
complemento conocido, e inactivar el complemento a 56 a
hora. Tenemos anticuerpo conocido, complemento conocido,
hemates de oveja con anticuerpo pegado, y nuestro
problema con o sin antgeno .
Si no hay antgeno los hemates rodeados de anticuerpo que
reconocen el antgeno, activndose el complemento
provocando las lisis Hemolisis -> Control positivo.
Si existe antgeno, los hemates rodeados de anticuerpo que
reconocen el antgeno, pero como no hay complemento libre
no se produce la lisis de los hemates No hay hemolisis.
Se utiliza para detectar enfermedades provocadas por virus,
richetsia y hongos. El complemento tambin se utiliza para
purificar, matando especficamente aquellas clulas para las
que aadamos anticuerpo.
Tcnicas de ligando.
Marcamos el antgeno o el anticuerpo, sin modificar
sus propiedades de reconocimiento antgeno-
anticuerpo.
Podemos realizar el marcaje con:
Radioactividad RIA.
Enzimaticamente EIA, ELISA.
Emisin de luz.
Fluorescencia.
Radio Inmuno Anlisis (RIA)

Fue descrita por primera vez por Yalow/Bason. Con


concentraciones conocidas de anticuerpo marcado
radiactivamente y antgeno fro (Sin marcar). Es un
ensayo de competicin.
La tcnica se basa en medir la cantidad de antgeno
marcado que se desplaza de los lugares de unin del
anticuerpo debido a la llegada y posterior
competicin del antgeno fro (Que es la muestra
problema),
conociendo as la cantidad de antgeno fro que
tenamos en nuestra muestra. La medicin se realiza
de la fraccin libre que queda, antes y despus de la
adicin del antgeno fro.
Debemos precipitar los complejos para poder separar
las fracciones. Existen varios mtodos para ello:

Atrapar el ligando libre: Absorcin. A travs de


sustancias, que se pegan al antgeno libre y nos
queda el anticuerpo separado. Como sustancias se utilizan
el dextreno o partculas de carbono.
Hacer precipitar los inmunocomplejos. Existen varias formas:

Qumica: Sulfato amnico por ejemplo. Hace precipitar


el inmunocomplejo y nos queda la fraccin libre con
antgeno radioactivo.
Especfica con anticuerpo: Usamos un anticuerpo frente
a anticuerpos, quedando libre el antgeno marcado.
Unido a una fase slido. Pegamos en una membrana,
tubo o bolitas, inmovilizando losinmunocomplejos o el
antgeno.
Dado que utiliza radioactividad es muy sensible. La
mas sensible de todas estas tcnicas, pudiendo llegar
a detectar cantidades del orden de picogramos.
De todas formas, tras el experimento, hay que realizar
una curva patrn para extrapolar nuestras muestras.
En estos ltimos aos est siendo
prcticamente desbancada por otra tcnica,
el ELISA, que a pesar de ser menos
sensible, utiliza reacciones enzimticas en
lugar de radiacin, haciendo el ensayo ms
sencillo y menos
peligroso para la salud de los operadores.
Enzyme Link Inmuno
Solvent Assay (ELISA)
Utiliza un anticuerpo unido a un enzima.
Tambin necesitamos separar la fraccin
unida de la libre.
Utilizamos mayoritariamente un soporte
slido de plstico. Se utilizan placas de
96 pocillos para testar varias cosas a la
vez y abaratar costes. Fue descrita en el
ao 1961. Existen varios tipo de ELISA,
de los cuales
Veremos::
ELISA directo.

En un soporte slido de plstico, pegamos en el fondo el


antgeno que queremos analizar. Se bloquean los
huecos con protena (Albmina bovina normalmente).
Aadimos anticuerpo que reconoce el antgeno, ya
marcado con un enzima. Incubamos un tiempo y realizamos
lavados para quitar todo el anticuerpo que no se
ha pegado. La fraccin libre se tira. La cantidad de anticuerpo
con enzima que tengamos es proporcional a la
cantidad de antgeno. Aadimos un sustrato que en presencia
del enzima marcador, pasa a tomar un color
especfico (Sustancia cromgena). Por ejemplo, la peroxidasa
utiliza aminobendicina, que en presencia de
agua oxigenada pasa a agua y oxgeno, que oxida al DAB,
produciendo un color marrn. Ese color lo
podemos leer en un espectrofotmetro con los filtros adecuados.
ELISA indirecto.

En este caso el primer anticuerpo no est unido con el enzima de marcaje,


sin que necesitamos un anticuerpo
secundario marcado que reconozca al primero. Pasos:
Pegar el antgeno.
Bloquear con protena.
Aadimos el suero del enfermo (Si hay anticuerpos frente al antgeno,
se pegan).
Lavamos Separamos fracciones Tiramos la libre.
Aadimos el anticuerpo secundario marcado con un enzima. Suelen ser
anticuerpos frente ainmunoglobulinas humanas,.
Incubamos.
Lavado para eliminar anticuerpos libres.
Aadimos el cromgeno, a mas color mas anticuerpo y mas antgeno.
Nos permite cuantificar, al comparar con un control. Tendremos de
antemano una curva patrn especfica para
cada ensayo. Es necesario adems establecer rangos de positivo y
negativo.
ELISA competitivo.

Se trata en muchos aspectos a una tcnica similar al RIA.


Pegamos el antgeno al sustrato. Aadimosanticuerpo
primario. Aadimos antgeno libre igual al que est
pegado. Parte del anticuerpo se pega al pegado y otra al
libre. Al lavar nos llevamos la fraccin con anticuerpo
pegado al antgeno libre.
Aadimos el anticuerpo secundario marcado con enzima. El
color aparece tras el revelado, y a mayor antgensoluble
en la muestra, menor color obtendremos.
Es mas sensible que el resto de los ELISA. Tambin debemos
realizar una curva patrn con cantidades
conocidas de antgeno y anticuerpo.
Esta tcnica suele hacerse por triplicado, dada su sensibilidad. Debe
incluirse un control negativo de algo que
no debe reconocer ese anticuerpo, y un control positivo, para realizar
una recta patrn que nos permita
cuantificar. Se toma como resultado la media de los tres pocillos.
ELISA Sndwich.

Tendremos dos zonas de anticuerpo, en la parte de


abajo y de arriba. En el sustrato pegamos una
anticuerpo
que reconozca el antgeno a testar. Bloqueamos los
huecos con protena. Aadiremos el antgeno.
Lavamos
tras incubar. Ponemos otra vez anticuerpo que
reconozca el antgeno, que suele estar ya unido al
enzima
(Aunque puede hacerse con otra capa de anticuerpo).
Lavamos tras incubar y aadimos el cromgeno. A
mas
antgeno mas color.
Enzimas que se usan en los
ELISA.
Peroxidasa del rbano picante.
Fosfatasa alcalina.
Glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa.
Malato deshidrogenasa.
Galactosidasa.

El enzima elegido no debe de estar presente en el


medio que estamos analizando. Su funcin es la de
estar
inactivo hasta que deseemos activarlo.
Produccin de anticuerpos
monoclonales y
policlonales.
Al estar expuesto a un patgeno, muchas clulas del cuerpo se ponen a funcionar.
Una bacteria tiene muchos
determinantes antignicos, y muchos de ellos sern reconocidos. Dependiendo de
que determinantes
antignicos tengamos, habr mas anticuerpo de un tipo que del resto. El antisuero de
una persona inmunizada
tiene una mezcla de muchos anticuerpos, que proceden de linfocitos que se activaron
al reconocer un
determinante antignico. Como se han activado muchos clones, la respuesta es
policlonal. La mayor parte de
las respuestas son de este tipo.
Un anticuerpo monoclonal procede de un solo tipo de clon. En ocasiones, queremos
tener mucha cantidad de
un nico tipo de anticuerpo monoclonal, pero es muy difcil de purificar en un
antisuero de una respuesta
policlonal. Se buscaron tcnicas para obtenerlos. El problema es que no se pueden
tener clulas B
produciendo anticuerpo constantemente. Para obtencin de anticuerpos debemos:
Debemos seleccionar el antgeno (No todos los antgenos dan respuesta inmune). Surge una diferencia,
lo
que si da respuesta inmune es un inmungeno, que no es mas que un antgeno que inyectado da lugar a
una
respuesta inmune. Debe de tener un tamao grande (5000-10000). Los mejores son las protenas y los
peores los azcares. Otras sustancias, aunque son muy pequeas, si las asociamos a una protena
transportadora si son inmungenos. Se conocen como haptenos.
Debemos ver cual ser la va de inmunizacin, es decir, por donde meteremos el antgeno. La subcutnea
es
una de las que mejor respuesta inmune dan. Rara vez se usa intramuscular, y muy rara vez la va oral. En
animales se suele utilizar la va intraperitoneal, y obtenemos una respuesta sangunea que ir al bazo. La
intravenosa es la menos usada porque los antgenos pueden tolerarse. Para monoclonales se utilizar un
ratn por va intraperitoneal varias veces, seguido de una intravenosa, para extraer finalmente el bazo.
Si
aadimos adyuvantes, estos potenciarn la respuesta inmune, ya que enlentece la liberacin del
antgeno y
favorece la fagocitacin de este por los macrfagos. Suelen utilizarse emulsiones de aceite (Adyuvante
de
Freud), solucin ACUM o la toxina colrica.
Debemos escoger el animal que vamos a utilizar. Depende de la funcin que queramos realizar. En En
experimentacin utilizamos conejos para obtener anticuerpos policlonales, al igual que ovejas o el
hmster.
Si queremos anticuerpo monoclonales son fundamentalmente ratn (Mas frecuente) y rata.

Protocolos de
inmunizacin.
Lo mejor es inmunizar varias veces. Entre una
respuesta primaria y la segunda se tarda
menos. La primera vez se tardan semanas,
la segunda necesitamos menos tiempo y
obtenemos mas anticuerpo. Suelen
repetirse las inmunizaciones. Se realiza la
primera, tras 20-30 das las segunda,
dejamos dos o tres semanas y hacemos la
tercera, para finamente extraer el bazo. Los
tiempos varan entre los distintos
protocolos.
Obtencin de anticuerpos
policlonales.

Una vez preparado el antgeno (Por ejemplo,


linfocitos humanos), se inmuniza tres veces a
un conejo, y se le va sangrando cada cierto
tiempo, extrayendo el suero, donde tenemos
anticuerpo, que reconocen los linfocitos
humanos (Mezcla de anticuerpos). Si inyectaran
inmunoglobulina G humana, obtendramos
anticuerpos de
conejo frente a inmunoglobulina G humana. Si el
conejo se muere se acaba el ensayo. Adems
los lotes no
son reproducibles.
Obtencin de anticuerpos
monoclonales.
El desarrollo de esta tcnica vali el premio Nbel a dos
investigadores, Cesar Milstein y George Kohler (La
tcnica es de 1975, el Nbel en 1984).Trabajaban intentando
conocer los genes de los anticuerpos. Tenan un problema,
que tenan mezclas de clulas B, y queran tener una nica
clula B con un anticuerpo de especificidad conocida.
Queran comparar la secuencia proteica con la secuencia
de la inmunoglobulina.
Tenan las clulas de mieloma (Tumorales) que se pueden
inducir en el ratn. El anticuerpo que secretaba era de
especificidad desconocida. Unieron una clula B de
especificidad conocida con un mieloma. Consiguieron un
hibridoma, que son inmortales (Cultivables) que secreta
anticuerpos de especificidad conocida. Es el principio de la
tcnica de obtencin de anticuerpo monoclonales.
Inmunizaban varias veces un ratn por va intraperitoneal (2
veces) y tres veces por va intravenosa, para causar una mayor
respuesta en el bazo. Extraen el bazo y unen estas clulas al
mieloma, mediante virus que forman sincitios, pero tambin
agregando qumicos, como el polietinelglicol (PEG). Obtenemos
hbridos, pero existe un primer problema, ya que tenemos clulas
sin fusionar junto a los hbridos. Para poder distinguirlos,
las clulas de bazo mueren tras un tiempo, pero las clulas de
mieloma todava viven. Tenia que modificar las clulas de
mieloma para que en determinados medios selectivos se
murieran. Utilizaron la va de sntesis de nucletidos, para ver
como podan alterar estas clulas. Hay dos maneras de sintetizar
nucletidos, por la va de salvacin o la va de novo. La de
salvacin necesita dos enzimas, y la de novo solo uno. Al tener
mielomas deficientes en alguno de los enzimas de la va de
salvacin y bloqueando la de novo, las clulas morirn, pero el
hbrido conserva la enzima del linfocito B. As consiguieron que
solo sobreviviera el hibridoma. Para hacer que sea defectiva en
una va, forzamos a las clulas en medios anlogos a las vas, y si
sobreviven, es que ya no la usa. Hay sustancias txicas para la
enzima, y si sobreviven clulas es que ya no las usan.
Con la lnea de mieloma deficientes para un enzima, las fusionamos con las
clulas del bazo mediante el uso de PEG. En el cultivo en el medio correcto
solo sobreviven los hibridomas.

Cuando ya tenemos los hibridomas, testamos si estn produciendo o no


anticuerpo. Analizamos la produccin de anticuerpos en los pocillos. Lo
hacemos por distintas tcnicas, pero la mas frecuente es el ELISA. Lo
haremos teniendo una nica clula por pocillo, porque todos los
anticuerpos que produzca esta clula van a ser iguales (Monoclonales).
Para separar las clulas una en cada pocillo tenemos que hacer una
dilucin lmite, hasta que tengamos 0,3 clulas por pocillo, para tener la
probabilidad de que no hayan clulas en el pocillo o que tengamos
solamente una.

1000 cs 500 cs 250 cs 125 cs 125 cs ... 0,3 cs por pocillo.


Se comprueba en el microscopio, y se espera a que
crezca. Ya tenemos un clon que da anticuerpos
monoclonales. En otros pocillos habr otras clulas
que darn otro anticuerpo monoclonal.
Podemos tener estos clones indefinidamente o bien
congelarlos, obteniendo una produccin ilimitada
del
anticuerpo monoclonal obtenido. Son anticuerpos con
especificidad nica frente al antgeno. Todos tienen
idntica afinidad por el antgeno.
Usos e inconvenientes de los anticuerpos monoclonales.
Usos:

Identificacin de nuevas molculas.


Estudiar complejos proteicos.
Tipos de grupos sanguneos.
Medicin de niveles hormonales.
Deteccin de virus.
Deteccin de anticuerpos especficos.
Purificacin de molculas: Interfern.
Diagnstico de tumores.
Terapia:
Inmunosupresores.
Enfermedades infecciosas.
Cncer.
Intoxicaciones.
Problemas:

La mayora se generan en ratn, y al


utilizarlos en otras especies pueden
provocar rechazo.
Dificultad tcnica de reproducir hibridomas
humanos.
En terapia pueden tener efectos secundarios
por crossreactividad.
Pueden pasarse virus de otras especies.
Han intentado humanizar los anticuerpos de

ratn por ingeniera gentica.


Anlisis de anticuerpos.
Dilucin en agar: Utilizamos la propiedad de formacin de
colonias en placas petri con medio enriquecido, yal mezclarlo
con los hibridomas se formarn colonias independientes.
Podemos poner cada colonia en un pocillo independiente.
Debemos caracterizar los anticuerpos obtenidos. Para ello
utilizaremos tcnicas como el ELISA, el Western-Blot,
fluorescencia o inmunoprecipitacin.
Para la obtencin a gran escala, se cultiva en un medio donde
crecen las clulas, y los anticuerpos se van liberando.
Podemos obtener, en el caso de la inmunoglobulina G de 10-
50 0,5-2
Existen aparatos similares a ratones in vitro. La mayora de
constan de reservorios donde se ponen las clulas,con
membranas que permiten el intercambio gaseoso y lquido
con otro reservorio donde se encuentran los medios de
cultivo. Crecen las clulas y antes de morir liberan todo el
anticuerpo, y retiramos el lquido obteniendo unos 75-100 ml
con una concentracin de anticuerpo de 0,5-1 mg/ml.
Purificacin de
anticuerpos.
Cuando ya hemos obtenido un antisuero, este no est formado nicamente por
anticuerpo. Para su
purificacin, las tcnicas mas utilizadas son las basadas en cromatografa de
afinidad, donde podemos
purificar el anticuerpo y el antgeno. Existen tres cromatografas para ello:

Purificar antgeno: Hay una protena (Protena A) que tiene mucha afinidad por las
inmunoglobulinas
(Especialmente por la G), concretamente por la porcin Fc. Puede comprarse la
protena A asociada a
bolitas de ciertos polmeros. Diseamos una columna con la protena A mas el
anticuerpo y le pasamos la mezcla de antgeno, solo quedndonos los antgenos
en la columna, ya que el resto sale en el diluido. Hacemos lavados para quitar
todo aquello no especfico que nos quede. Separamos ahora el antgeno el
anticuerpo, ya sea bajando el pH o modificando la molaridad del buffer.
Normalmente el buffer es glicina a pH 3, para no estropear el antgeno.
Purificar anticuerpos especficos: La columna lleca bolitas de sephadex rodeadas
de antgeno, y hacemos pasar muestra con antgeno especfico mas otras cosas,
pero solo se un el anticuerpo
Western-Blot
Combina electroforesis con transferencia en membrana y posterior
incubacin con anticuerpo. Nos permite saber el peso molecular
de una determina protena. Lisamos las clulas, y realizamos una
electroforesis en gel de acrilamida, poniendo el lisado. Utilizamos
marcadores de peso molecular. Se hace doble, uno de ellos lo
teimos y otro lo transferimos a una membrana de nitrocelulosa o
nylon, mediante carga elctrica.
En esta membrana quedan pegadas las protenas. Ya
tenemos las protenas. Incubamos con anticuerpo contra lo
que queremos saber, y estos lo reconocen. Se lava y se
aade un anticuerpo secundario marcado
(Enzimticamente normalmente) que detecta el anticuerpo
primario. Aadimos el cromgeno, viendo la unin en color.
Comparando con el patrn de pesos moleculares, sabemos
el peso molecular del antgeno.
A veces esta tcnica no sale, pudiendo ser debido a que en el
proceso de ponerlos con SDS para cargar las protenas, el
anticuerpo se desnaturaliza.
Inmunoprecipitacin

Consiste en rescatar el antgeno de una mezcla utilizando el anticuerpo y


alguna tcnica que nos precipite los complejos antgeno-anticuerpo.
Tenemos anticuerpo que reconoce clulas humanas. Buscamos un
sustrato donde pegar el anticuerpo (Bolitas mas anticuerpo). A ellos
aadimos el lisado celular (Puede estar marcado). El antgeno se unir
al anticuerpo.
Para separar la fraccin unida de todo aquello que no se ha pegado,
centrifugamos, y quedar en el fondo las bolitas mas el complejo
antgeno-anticuerpo. Lavamos y centrifugamos repetidamente,
desechando todo lo no especfico. Ya solo tenemos las bolitas con el
complejo antgeno-anticuerpo. Hacemos una electroforesis con
control de peso molecular. El complejo antgeno-anticuerpo lo
desnaturalizamos con calor, y rompemos los puentes disulfuro.
Tendremos una banda de bolitas, otra de cadenas pesadas, ligeras y
otra con el antgeno.
Como es poco sensible, suele hacerse un Western-Blot posterior,
incubando la membrana con un anticuerpo marcado. Se pueden
realizar muchas variantes
Tcnicas de marcaje celular y visualizacin

Tcnicas con anticuerpo mas fluorescencia.


Los fluorocromos reciben luz a una determinada longitud de onda, y emiten a
otra longitud de onda que podr
ser detectado dentro de un espectro y otra en el rango de un color.
Con medios especiales que visualizan la fluorescencia, podemos ver los
anticuerpos.
Inmunofluorescencia
directa
En esta tcnica el anticuerpo est marcado directamente con
el fluorocromo.
Inmunofluorescencia indirecta
Es ms frecuente (Diagnsticos). En este caso el primer
anticuerpo no est marcado, y los anticuerpos que
seutilizan suelen ser monoclonales. Usamos un anticuerpo
secundario que reconozca el primer anticuerpo. Los
secundarios ya suelen ser policlonales.
Si pensamos que el enfermo detecta partes propias
(Enfermedades antiinmunes), ponemos tejidos humanos
aadimos suero del enfermo. El anticuerpo primario ser el
del suero, y el secundario ser frente a Y inmunoglobulinas
humanas.
Tambin puede hacerse sobre suspensiones celulares. En este
caso suele usarse para visualizarlos el citmetro de flujo.
Citmetro de flujo.

Es un aparato que pretende analizar una a una todas las clulas que pasan por
una capilar muy fino donde incide in rayo lser, y donde habr filtros y
espejos que nos dirn el tamao que tiene esa clula, su complejidad y si
va rodeada con fluorocromos de un color, otro o ambos. Los resultados
salen en una grfica tal y como nosotros le indiquemos. Por ejemplo, en
una grfica de tamao frente a complejidad obtendramos
esta grfica en una persona sana.
Podemos saber tantos por cientos de las distintas clulas
(Con distintos fluorocromos). Podemos pedir grficas
y tantos por cientos de todos los parmetros que mide el
citmetro de flujo.
El citmetro posee muchas mas funciones, y es de uso
obligatorio en centros hospitalarios, para la realizacin
de gran nmero de pruebas. Entre ellas cabe destacar:

Ver el contenido de DNA (En esporas y plantas por ejemplo).


Nos vale para poder ver algunas
leucomas (Clulas de divisin continua).
Ver si las clulas se mueren o no por apoptosis: Habr clulas con menos dotacin de 2n.

Separa poblaciones celulares: En citmetros con capacidad para hacerlo. Mezcla de clulas, por

ejemplo, con marcador verde en un tubo y rojas en otro. Cargamos gotas en el citmetro, y lo
sometemos a un campo elctrico, desplazando el tubo que nosotros queremos.
Microscopio de florescencia: Solo hay una distancia de trabajo, donde veremos la preparacin.
Microscopio confocal: Podemos en tejidos gruesos, enfocar en todo momento. Podemos adems
guardar todas
las imgenes secuencialmente y ponerlas forma tridimensional.
Microscopio electrnico: Mayor definicin, que tambin puede utilizar tcnicas inmunolgicas.
Inmunologa celular.
Tema 7:
Podemos ir a mdula o timo, pero lo normal es la utilizacin de la sangre, ya que la linfa es ms
difcil.
Tambin podemos ir a los ganglios linfticos. Tambin podemos obtener el bazo. Los rganos tienen
mezcla
de clulas. Se han desarrollado tcnicas de separacin celular.
Separacin por gradiente de densidad.
Usamos una sustancia que por centrifugacin nos las separe por gradiente de densidad.
Ahora, utilizamos una pipera pasteur para recoger la banda donde se encuentran los linfocitos
y lo pasamos a
un medio especfico. Centrifugamos para quitar el ficol (Sustancia densa). Hemos obtenido
linfocitos y
monocitos parcialmente purificados.
Adherencia a nylon (Linfocitos B, Macrfagos y clulas muertas).
El nylon tiene una serie de propiedades que hace que las clulas B, los macrfagos y las clulas
muertas se
adhieran a el. Podemos aprovechar esta capacidad para separar clulas de una mezcla.
Si queremos recuperar posteriormente los linfocitos B, junto con los macrfagos, debemos de
exprimir el
nylon, para que estas clulas se suelten del nylon.
Si lo queremos obtener son los macrfagos, existe un mtodo mas sencillo, utilizando un medio
plstico
donde se adhieren los macrfagos. Utilizamos una protena como la albmina para forrar el
plstico. Si
aadimos la mezcla, solo los macrfagos se pegarn. Al lavar nos quedaremos con ellos pegados, y
se irn las
dems clulas no adherentes. Para separarlos utilizamos o bien un agente qumico (Un querante de
calcio,
EDTA, tripsina...) o bien simplemente rascando el fondo de la placa plstica.
Rosetas con hemates de carnero.
Algunas clulas forman rosetas con los hemates de carnero. Lo hacen aquellas que presentan CD2
en su
membrana. Es el caso de los linfocitos T. Los linfocitos B y los macrfagos no presentan esta
molcula, y por
lo tanto no forman rosetas con estos hemates.

especfico. Lavamos. Bajamos el pH para separar y ya tenemos el anticuerpo especfico para una
sustancia.
Purificar anticuerpos no especficos: nicamente purificamos anticuerpo con la capacidad de
pegarse
a la protena A mas el sephadex. En la columna habr protena A mas sephadex y pasaremos las
muestras.
Existen otras protenas adems de la A, como la protena G o la L, que se unen a una cadena ligera
kappa.
Tambin pueden utilizarse otros tipos de cromatografa. Existen otras tcnicas para el anlisis y
purificacin
de los anticuerpos, como pueden ser el Western-Blot o la inmunoprecipitacin.
Avidez: Es el sumatorio de fuerzas que se establecen entre un antgeno y un anticuerpo. Una Ig
M unindose
por varios brazos tendr alta avidez aunque su afinidad sea pequea. Depende de la afinidad y de
las
valencias, as como de la estructura en el espacio.
Especificidad: Sera ideal cuando el anticuerpo solo reconoce un determinante antignico. No
siempre es
ideal.
Anticuerpo heterfilo: Se han generado frente a un determinado organismo y son capaces de
reconocer otras
cosas en otras especies distintas.
Crossreaccin: Posee reaccin cruzada. El anticuerpo detecta otras estructuras que no debera,
pero puede
llegar a ser til en las tcnicas.