Morfologa Microscpica

de Bacterias
Caractersticas tintoriales
 Caractersticas Tintoriales
Colorante:
Son compuestos orgnicos, aromticos y
coloreados, con un anillo arilo conteniendo
sistemas de electrones deslocalizados y que
tienen la capacidad de teir.
Los colorantes tienen como estructura base
al benceno
 Colorantes
Los colorantes constan de:
1) Un anillo aromtico (Base)
2) Un grupo cromforo (color)
3) Un grupo auxcromo (carga)
Anillo aromtico (benceno)
Es un sistema cerrado de dobles enlaces
conjugados
 Colorantes
Grupos Cromforos
Estos grupos imparten al compuesto la propiedad de color.

Configuraciones usuales
de cromforos
-C=C-,-C=N-,-C=O-
- N = N - (Azo) , - NO2 (Nitro) , Anillos Quinoideos , N = O (nitroso),
R1-N2O-R2 (Azoxi), C=N-N=C (Azina), N = (Indmico), C=S
(Tiocarbonilo), Tiazina
Colorantes
Cromgenos
Es la unin de un anillo aromtico con un
grupo cromforo
 Colorantes
Grupos Auxcromos
Son grupos que incrementan el color unindose a
una molcula ionizable, reteniendo su capacidad de
ionizarse

Grupos auxcromo
usuales
- NH2
- COOH
- HSO3 ,
- OH
 Efecto de un auxcromo
naftaleno, incoloro.
OH-
NO2-

1-naftol incoloro. Ionizable.

2,4-dinitronaftaleno, amarillo plido.

OH-

Amarillo Martius, muy intenso

 Alteracin del color por
modificadores

Pararosanilina rosa Violeta de metilo

Cristal violeta Verde de metilo

 Colorantes
Usos
a) Hacer visibles a los microorganismos
b) Estudio de estructuras microbianas
c) Distribucin y naturaleza qumica de los
constituyentes celulares
d) Establecer diferencias entre los microorganismos
e) Distinguir entre microorganismos vivos y muertos
f) Agente selectivo
g) Agentes bactericidas o bacteriostticos
 Colorantes
Clasificacin:
a) En funcin de su origen
- Naturales (fines histolgicos)
- Sintticos (tinciones microbiolgicas)
derivados de la anilina

b) En funcin de su carga
- cidos: carga negativa, tien
estructuras bsicas (carga +)
- Bsicos: carga positiva, tien estructuras
cidas (carga -)
- Neutros: Sales de un colorante cido y otro
bsico, algunos son liposolubles (tien
inclusiones citoplsmicas lipdicas)
Fucsina Verde de Malaquita

Naranja de Acridina cido Pcrico

Azul de Metileno
Cristal Violeta

Dimetil - Safranina Trimetil - Safranina

 Tinciones
Definicin de mordente:
Sustancia qumica sin poder colorante,
que acta como sustancia puente entre el
colorante y la estructura a teir,
permitiendo su coloracin.
En otros, altera su estructura celular,
permitiendo su tincin

cido fnico, cido tnico y lugol

 Tinciones
Preparado para una tincin
a) Extensin o frotis (frote)
Hacer una capa fina de microorganismos,
extendindolos con el asa bacteriolgica sobre un
portaobjetos

b) Fijacin:
Proceso que desnaturaliza o coagula las protenas del
microorganismo, para que ste quede adherido al
cristal del portaobjeto y mueran.
- Calor, Formaldehdo, Metanol, Tetraxido de osmio
 Tinciones
Tipos de tinciones:
1) Tincin simple
2) Tincin combinada o compleja
3) Tincin diferencial
4) Tincin selectiva
5) Tincin negativa
6) Tincin vital
 Tinciones
Tipos de tinciones:
1) Tincin simple: un solo colorante.
Forma, agrupacin, tamao y presencia de
esporas
2) Tincin combinada o compleja
Intervienen dos o ms colorantes
Tincin de Gram,
Tincin de Ziehl-Neelsen
Tincin de Shaeffer y Fulton.
 Tinciones
3) Tincin diferencial
Distingue un grupo de MOs de otro tomando un color
diferente, (criterio taxonmico)
Capacidad metablica
Produccin de enzimas especficas

4) Tincin selectiva
Pone de manifiesto las estructuras de la clula
aprovechando las propiedades fsicas o qumicas de
algunos de sus componentes, (afinidad a los
colorantes).
Tincin de: pared, esporas, flagelo, etc.
 Tinciones
5) Tincin negativa
La estructura de la clula no es teida por el
colorante, solo proporciona un contraste para
ponerla de manifiesto, en base a su bajo ndice de
refraccin.
Colorantes cidos
Cpsula

6) Tincin vital
Los MOs vivos pueden tomar el colorante por lo que
quedan teidos y los MOs muertos no adquieren el
color.
Actividad metablica
Azul de tetrazolio
 Tinciones

Tincin de Gram

Esta tincin tiene gran importancia en

taxonoma bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias.
 Tinciones

Basndose en su reaccin a la tincin

de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos:

a) Gram positivas
b) Gram negativas
 GRAM POSITIVA
PEPTIDOGLICANA
(POLISACRIDOS Y GLICOPPTIDOS)

MEMBRANA CITOPLSMICA
(FOSFOLPIDOS, PROTENAS Y OLIGOSACRIDOS)

GRAM NEGATIVA

FOSFOLPIDOS MEMBRANA
LIPOPOLISACRIDOS EXTERNA
Y PROTENAS
GRAM NEGATIVA

PEPTIDOGLICANA
(POLISACRIDOS Y GLICOPPTIDOS)

MEMBRANA CITOPLSMICA
(FOSFOLPIDOS, PROTENAS Y OLIGOSACRIDOS)
 Tincin de Gram
Caractersticas de la Pared

Pared Gram (+) Pared Gram ()

Capa densa y uniforme Capa interna delgada (5
de 20 a 80 nm a 10 nm) cubierta por
Glicopptido (50% del capas externas de
peso seco) densidad menor
cidos Teicoicos Glicopptido (10% del
Polisacridos peso seco)
Protenas (pocas veces) Lipopolisacrido (LPS)
Lipoprotenas
Protenas
 Tcnica de Tincin de Gram
1.- Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar
al aire y fijarlo al calor.
2.- Cubrir el portaobjetos con Cristal violeta, tiempo un minuto.
3.- Escurrir y lavar al chorro suave de agua.
4.- Adicionar lugol, tiempo un minuto.
5.- Escurrir y lavar al chorro suave de agua.
6.- Decolorar con alcohol-acetona, tiempo 5 a 15 segundos.
7.- Lavar inmediatamente al chorro suave de agua.
8.- Cubrir el frotis con safranina, tiempo un minuto.
9.- Escurrir, lavar al chorro suave de agua y dejar secar al aire.
10.-Observar con el objetivo de inmersin (100X).

Gram positivas: color violeta intenso

Gram negativas: color rojo.
Tincin de Gram
Pared Celular Bacterias
FUNDAMENTO
 Fundamento de la tcnica
de Gram

La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y

Gram negativas se establece en la naturaleza de la
pared celular bacteriana.
Fundamento de la tcnica
de Gram
Gram (+)
Poseen una pared gruesa de
peptidoglicana, capaz de
retener al complejo cristal
violeta-yodo.
Durante la decoloracin con
alcohol- acetona se provoca
una deshidratacin de la
pared y reducindose la
porosidad, quedando
atrapado el complejo dentro
de la pared celular.
Fundamento de la tcnica
de Gram
En las Gram (-), la
capa delgada de
peptidoglicana no
puede impedir la
salida del complejo
colorante-mordente,
por lo que pierde el
colorante primario y se
tie con el colorante
secundario o de
contraste.
 Gram positivos
Streptococcus pneumoniae

Clostridium tetani

Corynebacterium diphtheriae
 Gram negativos
Escherichia coli
Bordetella pertussis
 Tincin de Ziehl-Neelsen
Tincin diferencial
Desarrollada inicialmente por Paul
Ehrlich para poner de manifiesto la
presencia de los bacilos causantes de
tuberculosis en muestras clnicas de
pacientes.
Ziehl
Neelsen
 Tincin de Ziehl-Neelsen
1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar al aire y
fijarlo al calor.
2.-Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada.
3.-Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de
vapores (5 min.). El colorante no debe hervir ni secarse,
aadir ms colorante si es necesario.
4.-Lavar con agua
5.-Decolorar exhaustivamente con alcohol-cido.
6.-Lavar con agua.
7.-Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto
8.-Lavar con agua, escurrir, dejar secar.
9.-Observar con objetivo de inmersin.
ZN+ o BAAR: color rojo intenso.
NAAR: color azul.
Tincin de Ziehl-Neelsen
Pared celular Mycobacterium
 Fundamento de la tincin
de Ziehl-Neelsen
Mycobacterium y Nocardia
Pared celular un alto contenido de cidos grasos de
cadena muy larga: ceras, cidos miclicos y nocrdicos,
respectivamente.

1) Calentamiento con el colorante primario,

Fusin de las ceras y aumenta la energa cintica de las
molculas de colorante, hay penetracin a la clula.
2) La mezcla colorante-fenol es mas soluble en los cidos grasos
bacterianos, contribuye a su permanencia en la pared.
3) Lavar con agua fra provoca la solidificacin de las ceras dejando
al colorante queda atrapado en la pared.
 Fundamento de la tincin de
Ziehl-Neelsen
4.) Decoloracin exhaustiva. Proceso de decoloracin es muy
enrgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes
lpidos perder el colorante primario durante la decoloracin y
tomar el colorante de contraste.

Importancia

Es una prueba de diagnstico de Mycobacterium

tuberculosis

Es una prueba de identificacin de Mycobacterium

leprae,
 Tinciones selectivas
Objetivo: poner de manifiesto las estructuras de las
clulas aprovechando las propiedades qumicas o
fsicas de algunos de sus componentes, o bien,
proporcionar informacin acerca de la naturaleza de
ciertas estructuras a travs de su comportamiento
tintorial.

Estas tcnicas, se basan en que la estructura celular

que se desea poner de manifiesto tiene afinidad
mayor por los colorantes utilizados que el resto de la
clula.
 Tincin de Esporas
Tcnica de Schaeffer y Fulton
1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar
al aire y fijarlo al calor.
2.-Cubrir el portaobjetos con verde de malaquita.
3.-Calentar suavemente con el mechero hasta la
emisin de vapores (5 min.). El colorante no debe
hervir ni secarse, aadir ms si es necesario.
4.- Escurrir y lavar con agua
5.-Cubrir el frotis con safranina durante un minuto
8.-Lavar con agua, escurrir, dejar secar.
9.-Observar al microscopio con el objetivo de
inmersin.

Endosporas bacterianas: color verde.

Cuerpo bacteriano: color rojo-naranja
Observacin de esporas
 Tincin de Cpsula
Tcnica de Duguid (Tinta China)
1. Colocar en un portaobjetos una gota
de agua y una de tinta China.
2. Hacer una suspensin del microorganismo en la gota de agua
3. Mezclar la suspensin de microorganismos con la gota de tinta
China.
4. Colocar un portaobjetos sobre la mezcla cuidando que no se
formen burbujas de aire
5. Observar a objetivo de inmersin (100X)

La cpsula se observa como huecos refringentes rodeados de

partculas de carbn, que aparecen y desaparecen dentro de la
preparacin
 Tincin de Cpsula
Tcnica de Rojo Congo

1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar al aire y

NO fijarlo al calor.
2.-Cubrir el portaobjetos con mordente de cpsula y dejar por
un minuto .
3.- Enjuagar suavemente con agua destilada
4.- Escurrir y dejar secar al aire.
5.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100X).

La cpsula se observa como huecos brillantes y transparentes

en un fondo oscuro. El cuerpo bacteriano a veces se hace
visible de un color rosa tenue.
 Tincin de Pared Celular
Tcnica de Knaysi

1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar al aire y

fijarlo al calor.
2.-Cubrir el portaobjetos con mordente de Knaysi y dejar por
10 minutos .
3.- Enjuagar con agua destilada.
4.- Escurrir y colocar una gota pequea de fucsina fenicada.
5. Colocar un cubreobjetos evitando que queden burbujas de
aire.
6.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100X).

La pared celular se observa como una zona engrosada ms

oscura en la periferia de la clula y el citoplasma se observa
color rosa tenue.
Observacin de grnulos
metacromticos
Tincin de Flagelos
Tcnica de Leifson con
Plata.
Tinciones fluorescentes
Tinciones Vitales
Clulas vivas: color verde
Clulas muertas: color rojo
Micrococcus luteus (coco)
Bacillus cereus (bacilo)