Latar Belakang Pemilihan Tanaman
Berdasarkan penggunaan
tradisional dalam
masyarakat dan studi
literatur tanaman dalam
famili yang sama
Penggunaan tanaman
rimpang temu-temuan
sudah banyak dirasakan
manfaatnya oleh
masyarakat seperti jahe,
kunyit, temu lawak dll.
Disamping itu penelitian
tentang tanaman-tanaman
ini juga sudah banyak
dipublikasikan sebagai
bukti ilmiah yang nyata.
Berdasarkan penggunaan
Berdasarkan studi literatur
tradisional dalam
masyarakat
Studi literatur mengenai
Penggunaan tanaman
rimpang temu ireng sudah temu ireng sudah mulai
mulai banyak dirasakan dipublikasikan walaupun
manfaatnya dalam tidak sebanyak jahe, kunyit
masyarakat diantaranya dan tanaman satu famili
adalah sebagai lainnya. Namun salah satu
antihelmintik, karminatif, literatur menyatakan
peluruh dahak dll bahwa ekstrak etanol temu
hitam memiliki aktivitas
dalam membunuh sel
kanker seperti sel Breast
carcinoma (MCF-7) dan
cervical carcinoma (Ca Ski)
Beberapa hal diatas menjadi alasan kami untuk
mengisolasi senyawa murni dari rimpang temu
ireng (temu hitam) Curcuma aeruginosa Roxb.
Preparasi Sampel
Alat dan Bahan
Alat Bahan
2 buah pisau 1 kg Temu ireng
1 buah telenan
1 buah tampah
1 buah timbangan
manual
1 lembar kertas
putih polos
(flipchart)
Prosedur kerja
1. Pengumpulan Bahan Baku

Bahan baku Temu Ireng (Curcuma aeruginosa L) diperoleh dari

Pasar Ciputat,yang dibeli pada hari Minggu,13 September 2015
pukul 15.30 WIB. Bahan yang digunakan pada praktikum
sebanyak 1 Kg. Bagian yang digunakan untuk praktikum adalah
rimpang .

Pemilihan bahan praktikum kami lakukan berdasarkan

etnobotani. Pemanenan rimpang diambil biasanya dilakukan
pada musim kering dengan tanda-tanda mengeringnya bagian
atas tanaman.

Berat temu
ireng sebelum
dikeringkan
2. Sortasi Basah

Rimpang temu ireng dibersihkan dari pengotor asing yang

menempel pada rimpang dan membuang bagian rimpang yang
mengalami pembusukan.

Untuk menghilangkan pengotor yang terdapat dibagian

kulit rimpang dan bagian yang mengalami kerusakan
atau kebusukan.

Selasa,15 September 2015

15.00-16.00 WIB
3. Pencucian

Rimpang temu ireng dicuci dengan menggunakan air mengalir dan

dibersihkan dengan perlahan hingga tanah yang masih menempel hilang
semua.

Untuk menghilangkan pengotor dalam berbagai bentuk

seperti tanah,debu,dan mikroba

Proses pencucian
temu ireng

Selasa,15 September 2015

15.00-16.00 WIB
5. Perajangan

Rimpang temu ireng yang telah dicuci dirajang dengan memotong bagian
simplisia temu ireng dengan ketebalan yang merata . Dan meletakkan
simplisia diatas tampah yang telah dilapisi oleh flichart dan ditata dengan
rapi agar tidak ada simplisia yang saling tumpang tindih.

Untuk memperkecil ukuran rimpang temu ireng sehingga

mempermudah proses pengeringan

Proses Proses
pemoton penataan
gan temu temu
ireng ireng

Selasa,15 September 2015

15.00-16.00 WIB
5. Pengeringan

Rimpang temu ireng dikeringkan dengan cara dikering anginkan dan tidak
langsung terkena sinar matahari.

Memiliki tujuan untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah

rusak,sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama dan
mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik akan
dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia.

15 -20 September 2015

6. Sortasi Kering

Setelah simplisia mengering dilakukan penyortiran bahan,apa ada

simplisia yang busuk atau rusak.

Memiliki tujuan untuk memisahkan benda-benda asing seperti

bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor-
pengotor lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia
kering.

Minggu , 20 September 2015

7. Penghalusan

Simplisia yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan blender

hingga menjadi ukuran yang lebih kecil .

Memiliki tujuan untuk memperluas permukaan dan

mempermudah proses penetrasi pelarut kedalam
membran sel pada proses ekstraksi.

Senin, 21 September 2015

18.30-19.00 WIB
 EKSTRAKSI
Ekstraksi merupakan tahap awal
yang penting dalam proses isolasi
senyawa dari tumbuhan
Pengertian
Simplisia
Bahan alami yang digunakan untuk obat dan belum mengalami
perubahan proses apa pun, dan kecuali dinyatakan lain umumnya
berupa bahan yang telah dikeringkan.

Ekstraksi
Penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari
bahan yang tidak larut dengan menggunakan pelarut cair

Ekstrak
Sediaan yang diperoleh dengan mengektraksi senyawa aktif dari
simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan
massa atau serbuk yang tersisa diperlukan sedemikian hingga
memenuhi baku yang telah ditetapkan.
 1. Maserasi

Pelarut
2. Perkolasi
Organik

3. Sokletasi
Cara
Tradisional
1. Dekokta

Pelarut air 2. Infusa

Ekstraksi

1. Ekstraksi 3. Destilasi
ultrasonik uap

2. Ekstraksi dengan bantuan

Cara Modern
irradiasi microwave

3. Ekstraksi fluida superkritis

EKSTRAKSI MASERASI (Perendaman)

Maserasi adalah proses penyarian senyawa dari

simplisia tumbuhan cara dingin dengan menggunakan
metode perendaman.

Cara kerjanya adalah sampel yang telah dihaluskan

dengan derajat kehalusan tertentu direndam dalam suatu
bejana yang tertutup dan terlindung dari cahaya matahari
langsung selama lebih kurang 1 2 hari.

Perendaman biasanya dilakukan sebanyak 2 kali

perulangan, dimaksudkan agar proses perendaman
dapat menyari kandungan kimia tumbuhan dengan
sempurna
Alasan Memilih Metode Maserasi
Merupakan teknik ekstraksi yang aman karena maserasi adalah salah satu jenis
metoda ekstraksi dengan sistem tanpa pemanasan atau dikenal dengan istilah
ekstraksi dingin, jadi pada metoda ini pelarut dan sampel tidak mengalami pemanasan
sama sekali.

Kita tidak tahu senyawa yang akan diisolasi termolabil atau tidak, adapun maserasi
merupakan teknik ekstraksi yang dapat digunakan untuk senyawa yang tidak tahan
panas ataupun tahan panas

Jenis dan jumlah senyawa aktif yang dapat terekstrak tergantung pada sifat
kepolaritasan senyawa dalam temuireng yang belum diketahui sepenuhnya. Sehingga
diharapkan melalui metode maserasi tersebut, senyawa aktif yang terkandung dalam
temuireng dapat tertarik seluruhnya baik yang bersifat polar, semipolar hingga
nonpolar.
 a). Unit alat yang dipakai a) Proses penyariannya

KELEMAHAN
KELEBIHAN
sederhana, hanya tidak sempurna, karena
dibutuhkan zat aktif hanya
bejana per mamputerekstraksi
endam sebesar 50% saja
b). Biaya operasionalnya b) Prosesnya lama,
relatif rendah butuh waktu beberapa
c). Prosesnya relatif hari.
hemat penyari dan tanpa
pemanasan
Alasan Pemilihan Pelarut Etanol 96 %

Pelarut etanol dapat menembus semua jaringan tanaman untuk menarik senyawa aktif keluar
dari jaringan sel bahan.

Etanol tidak menyebabkan pembengkakan pada membran sel dan memperbaiki

stabilitas bahan obat terlarut, sifatnya yang mampu mengendapkan albumin dan
menghambat kerja enzim

Etanol punya polaritas yang tinggi sehingga dapat melarutkan hampir semua bahan
organik baik senyawa polar maupun senyawa semipolar, sehingga senyawa-senyawa
kimia aktif seperti flavonoid, alkaloid, tannin, dan saponin dapat terlarut dalam pelarut.

Karena hasil simplisia sudah kering, lebih baik menggunakan dengan etanol 96 %

Penggunaan etanol mengacu pada jurnal yang juga mengisolasi temuireng

 1. Botol gelap (wadah maserasi)
Maserasi : Selasa 22 September 2. Vacuum rotary evaporator
2015 Pukul 13:00 Rabu, 23
3. Alat pengaduk
September 2015 Pukul 14:30
4. Kapas
Remaserasi : Rabu, 23 5. Kertas saring
September 2015 Pukul 14:30 - 6. Spatula
Jumat, 25 September 2015 7. Timbangan Analitik
Pukul 10:00
8. Corong
9. Cawan Penguap

METODOLOGI
- Serbuk halus simplisia kering
(217,78 gram) EKSTRAKSI
- Etanol 96 % (1,5 L)
Langkah Kerja
1.
Menimbang
serbuk
simplisia
yang telah
dihaluskan
dan
memasukkan
ke dalam
botol gelap

Derajat kehalusan simplisia

Semakin halus, luas kontak permukaan akan semakin besar sehingga
proses ekstraksi akan lebih optimal
Penggunaan botol gelap
Agar tercapai kondisi yang terlindung dari cahaya, karena jika terkena
cahaya , senyawa bisa berubah.
2. Menambahkan pelarut etanol 96 % sebanyak 750
ml untuk maserasi sampai serbuk simplisia terendam
dan terdapat lapisan pelarut setinggi 2,5 cm di atas
serbuk simplisia, begitu pula untuk remaserasi
menggunakan etanol 96 % sebanyak 750 ml
 3. Melakukan maserasi
simplisia selama 2 hari dan
remaserasi selama 3 hari
sambil diaduk secara
berkala

Pengadukan pada proses maserasi dapat menjamin

keseimbangan konsentrasi bahan yang diekstraksi
Hasil penyarian dengan cara maserasi perlu dibiarkan
selama waktu tertentu (2-3 hari) untuk mengendapkan zat-
zat yang tidak diperlukan tetapi ikut terlarut dalam cairan
penyari, seperti: malam dan lain-lain
Lama ekstraksi akan menentukan banyaknya senyawa-
senyawa yang terambil. Semakin lama ekstraksi ,semakin
bertambah banyak ekstrak yang didapatkan
4. Menyaring maserat menggunakan
Menyaring kembali filtrat yang dihasilkan
kapas yang dipasang di atas corong
dengan menggunakan kertas saring
sehingga di dapatkan filtrat

Tujuan dilakukan
penyaringan untuk
menghasilkan
maserat jernih dan
tanpa pengotor
Tujuan
penyaringan
dengan kapas :
untuk menyaring
serbuk simplisia
dengan ukuran
besar
Tujuan
penyaringan
dengan kertas
saring untuk
menyempurnakan
proses
penyaringan
 5. Menguapkan pelarut dalam filtrat
yang didapatkan dengan
menggunakan vacuum rotary
evaporator hingga didapatkan ekstrak
kental

Penguapan dengan vacuum

rotary evaporator untuk
memperoleh kembali pelarut
dan ekstrak pekat.
Hal ini karena tekanan yang
diperoleh dari rotary
evaporator menyebabkan
etanol dapat menguap
dibawah titik didihnya
sehingga suhu yang
digunakan tidak terlalu tinggi
dan tidak merusak ekstrak
yang diperoleh
 6. Menimbang ekstrak kental
yang didapatkan dan
menentukan rendemennya

Berat Ekstrak
Organoleptis Ekstrak
Maserasi 7.61 gram
Bentuk Kental
Remaserasi 9.5683 gram
Warna Coklat
kehitaman
13.1339 gram
Bau khas

Rasa -
*Berat Cawan Kosong = 23,1873
gram
Perhitungan Rendemen Ekstrak
Diketahui :
Berat awal sampel = 1 kg = 1000
gram
Berat total ekstrak kental = 13,1339 gram

Rendemen = x 100 %

13,1339
Rendemen = x 100 % = 1,313 %
1000
Hasil
Bobot rimpang temu ireng Bobot rimpang temu ireng
sebelum dikeringkan sesudah dikeringkan

1 kg 217,78 g
 PARTISI
Ekstraksi Cair-Cair

Proses pemisahan zat terlarut

didalam 2 macam zat pelarut yang Prinsip dari ekstraksi cair-cair
tidak saling bercampur atau adalah pemisahan senyawa
dengan kata lain perbandingan berdasarkan tingkat kepolarannya
konsentrasi zat terlarut dalam menggunakan dua pelarut yang
pelarut organik dan pelarut air. tidak saling bercampur. Prinsip ini
Hal tersebut memungkinkan dikenal dengan like disolve like,
karena adanya sifat senyawa yang artinya pelarut akan melarutkan
dapat terlarut dalam air dan senyawa yang tingkat kepolaran
adapula senyawa yang dapat larut yang sama dengan pelarut
dalam pelarut organik. tersebut.
Tujuan Partisi

Memisahkan senyawa yang terkandung

pada ekstrak temu ireng berdasarkan
perbedaan kepolaran ( polar, semi polar
dan nonpolar) sehingga memudahkan
dalam proses isolasi dan identifikasi
senyawa.
 Alat dan Bahan

1. Corong pisah
2. Gelas ukur 1. Ekstrak etanol rimpang temu
3. Gelas beker ireng
4. Cawan penguap 2. Pelarut non-polar (N-Heksan)
5. Vial 3. Pelarut semipolar (Etil Asetat)
Proses Partisi
(Cara Kerja, Hasil dan
Pembahasan)
1 Penyiapan ekstrak etanol temu ireng
Ekstrak etanol temu ireng yang diperoleh
proses maserasi digunakan semuanya
setelah
untuk
proses partisi ( ... mg). Ekstrak yang kental
ditambahkan etanol secukupnya dan diaduk
hingga mudah dituang.

2 Penyiapan pelarut nonpolar

Disiapkan pelarut nonpolar (N-Heksan) dan
semipolar (etil asetat) masing-masing dalam gelas
ukur 50 ml dan ditutup dengan alumunium foil.

Selasa, 6 Oktober 2015

3 Partisi I dengan pelarut nonpolar
Ekstrak yang telah diencerkan dimasukkan ke
dalam corong pisah dan ditambahkan 50 ml N-
Heksan. Lalu dikocok dengan posisi kran agak
keatas dan kran dibuka beberapa kali untuk
mengeluarkan udara yang terjerat lalu dikocok
kembali. Diamkan selama beberapa waktu
sampai terjadi pemisahan.
Setelah terjadi pemisahan, kedua lapisan cairan
ditampung dalam wadah yang berbeda dimana
lapisan atas merupakan fraksi n-heksan dan
lapisan bawah merupakan fraksi etanol (BJ n-
heksan< BJ etanol)

Hasil : didapatkan fraksi nonpolar (n-heksan) dan

fraksi etanol yang akan digunakan untuk partisi
selanjutnya
Selasa, 6 Oktober 2015
13.30 14.00
4 Partisi II dengan pelarut nonpolar
Fraksi etanol yang diperoleh setelah partisi I
dipartisi kembali dengan n-heksan 50 ml
(dengan cara kerja yang sama) agar senyawa
nonpolar yang masih tertinggal pada fraksi
etanol dapat dipisahkan sempurna. Partisi
dilakukan sampai pelarut n-heksan yang
digunakan berwarna bening yang menunjukkan
tidak ada lagi senyawa nonpolar yang terlarut
dalam pelarut.

Hasil : didapatkan fraksi nonpolar (n-heksan) dan

fraksi etanol

Selasa, 6 Oktober 2015

13.30 14.00
5 Partisi I dengan pelarut semipolar
Fraksi etanol yang diperoleh setelah partisi
dengan n-heksan kemudian dipartisi dengan
pelarut semipolar (etil asetat) dengan cara kerja
yang sama.

Setelah terjadi pemisahan kedua lapisan cairan

dipisahkan ke dalam wadah yang berbeda
dimana lapisan atas merupakan etanol dan
lapisan bawah merupakan etil asetat (BJ etanol <
BJ etil asetat)

Hasil : didapatkan fraksi semipolar (etil asetat)

dan fraksi etanol yang akan digunakan untuk
partisi selanjutnya

Selasa, 6 Oktober 2015

14.00 15.00
6 Partisi II dengan pelarut semipolar

Fraksi etanol yang diperoleh setelah partisi I

dipartisi kembali dengan etil asetat 50 ml
(dengan cara kerja yang sama) agar senyawa
semipolar yang masih tertinggal pada fraksi
etanol dapat dipisahkan sempurna.

Hasil : didapatkan fraksi semipolar (etil asetat)

dan fraksi etanol

Selasa, 6 Oktober 2015

14.00 15.00
7 Partisi III dengan pelarut semipolar
Fraksi etanol yang diperoleh setelah partisi II
dipartisi kembali dengan etil asetat 50 ml
(dengan cara kerja yang sama) agar senyawa
semipolar yang masih tertinggal pada fraksi
etanol dapat dipisahkan sempurna. . Partisi
dilakukan sampai pelarut n-heksan yang
digunakan berwarna bening yang menunjukkan
tidak ada lagi senyawa nonpolar yang terlarut
dalam pelarut.

Hasil : didapatkan fraksi semipolar (etil asetat)

dan fraksi etanol

Selasa, 6 Oktober 2015

14.00 15.00
7 Evap Hasil Partisi ( Fraksi etanol, etil
asetat & n-heksan
Hasil partisi fraksi etanol, etil asetat dan n-
heksan dimasukkan ke dalam 3 wadah yang
berbeda lalu kemudian di evap masing-masing
sampai didapatkan ekstrak yang kental.

8 Penyimpanan Ekstrak Hasil Partisi

Setelah ketiga fraksi dievap, masing-masing
fraksi dimasukkan ke dalam 3 vial yang berbeda
yang sebelumnya telah diimbang berat
kosongnya. Lalu ketiga vial ditutup dengan
aluminium foil dan dilubangi dengan jarum agar
pelarut yang masih tesisa dapat diuapkan,
kemudian disimpan dalam lemari

Rabu, 7 Oktober 2015

10.30 11.00
8 Penimbangan Masing-masing Fraksi

Setelah seminggu penyimpanan masing-masing

vial ditimbang. Dan hasil penimbangan dikurangi
dengan berat vial kosong untuk mengetahui
bobot fraksi yang diperoleh.

HASIL :
Fraksi etanol = 2,7483 gr
Fraksi etil asetat =3,4911 gr
Fraksi n-heksan =2,8644 gr

Selasa, 13 Oktober 2015

14.15 14.20
 KRO M AT O G RAFI
L AP I S T I P I S (KL T )
Selasa, 13 Oktober
2015
Pukul 14.20-15.45
TUJUAN?
- Memisahkan substansi campuran
menjadi komponen-komponennya
- Deteksi Pendahuluan
- Analisis fraksi yang
diperoleh dr Kromatografi
Kolom
Alat dan Bahan
ALAT BAHAN:
1. Plat KLT 1. Ekstrak Temu
2. Pipa kapiler Ireng
3. Chamber (Wadah 2. N-heksana, etil
plat KLT) asetat, etanol
4. Kertas saring 3. Reagen Godin
5. Lampu UV 4. H2SO4 10%
1
Mempersiapkan
KLT
-Memotong plat KLT (3x5 cm)
- Memberi tanda 0,5 cm dari bawah dan 1 cm dari atas pada
plat KLT

FASE DIAM :
Silica GF254
-Silika gel : tdk bereaksi dgn pereaksi2 yg lebih reaktif
(H2SO4)
- Mekanisme sorpsi : Adsorpsi
- GF254 : Gypsum sbg pengikat + berfluoresensi pd
254 nm
- Bersifat polar senyawa polar terjerap lebih kuat
 Menjenuhkan
s2
Chamber
1. Memasukkan fase gerak (eluen) yaitu campuran pelarut
dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (9:1) dengan
total volume 10 ml ke dalam chamber
2. Memasukkan potongan kertas saring menutup
chamber membiarkan kertas saring terbasahi

FASE GERAK = ELUEN

Digunakan campuran 2 pelarut organik daya elusi
nya mudah diatur pemisahan optimal
Pemilihan eluen berdasarkan polaritas senyawa
Kepolaran eluen berpengaruh thd Rf identifikasi
senyawa dalam sampel (Rf khas utk senyawa tertentu)
 Menjenuhkan
s2
Chamber
1. Memasukkan fase gerak (eluen) yaitu campuran pelarut
dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (9:1) dengan
total volume 10 ml ke dalam chamber
2. Memasukkan potongan kertas saring menutup
chamber membiarkan kertas saring terbasahi

PEMILIHAN ELUEN, Berdasarkan:

1. Adsorben pada fase diam
2. Struktur komponen yg akan dipisahkan
 Menjenuhkan
s2
Chamber
1. Memasukkan fase gerak (eluen) yaitu campuran pelarut
dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (9:1) dengan
total volume 10 ml ke dalam chamber
2. Memasukkan potongan kertas saring menutup
chamber membiarkan kertas saring terbasahi

Sebelumnya, eluen n-
Coba menambahkan rasio non
heksana:etil asetat (4:1)
Eluen polar (n-heksana) eluen
fraksi n-heksana = pemisahan
dipilih dg n-heksana:etil asetat (9:1)
jelas + banyak bercak (dibanding
cara trial diharapkan dpt mengangkat
fraksi etil asetat & etanol)
and error bercak yg masih belum
senyawa pd temu ireng bersifat
terpisah sempurna
non polar
 Menjenuhkan
s2
Chamber
1. Memasukkan fase gerak (eluen) yaitu campuran pelarut
dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (9:1) dengan
total volume 10 ml ke dalam chamber
2. Memasukkan potongan kertas saring menutup
chamber membiarkan kertas saring terbasahi

Penjenuhan dgn kertas saring:

Utk memastikan eluen terdistribusi merata pd seluruh
bagian chamber menghilangkan uap air dlm chamber
+ tekanan dlm chamber tdk mempengaruhi proses
agar tdk mempengaruhi perambatan bercak
 Melarutkan
3
Fraksi Ekstrak
Melarutkan 3 fraksi ekstrak dgn sedikit pelarut masing2 (n-
heksana, etil asetat, etanol)

Supaya ekstrak menjadi larutan

cuplikan (sampel) untuk
ditotolkan pada plat KLT
 Menotolkan
4
Ekstrak
Menotolkan 3 sampel pada
plat KLT pada garis bawah
dengan pipa kapiler
N-heksana Etil Etanol
asetat

- Menotolkan dg ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin

menghindari pelebaran bercak & meningkatkan resolusi
- Pelebaran bercak mengganggu nilai Rf (akan ada himpitan
puncak)
- Penotolan dilakukan 1-2 totol dgn pengeringan antar totolan
 Mengembangka
4
n Sampel
1. Mencelupkan tepi bagian bawah
plat KLT yang telah ditotoli
sampel ke dalam fase gerak
2. Mengeluarkan plat KLT dari
chamber setelah eluen mencapai
batas atas

- Tinggi fase gerak harus dibawah tepi

bawah garis plat KLT
- Selama proses elusi, chamber
kromatografi harus ditutup rapat
 Mengembangka
4
n Sampel

Fase gerak bergerak dlm fase diam

karna gaya kapiler
 Mendeteksi
5 senyawa di lampu
UV (fisika)
Mengamati plat KLT dibawah sinar UV 254 (deteksi
universal) memberi tanda bercak

- Sinar UV 254 nm lempeng berfluoresensi kehijauan,

sampel gelap
- Penampakan bercak : interaksi sinar UV-indikator
fluorensensi pd lempeng
 Mendeteksi
5
Senyawa dg
reagen Godin
1. Menyemprotkan plat (
KLTk
dg ireagen
mgodin
iawi)
(vanillin 1% dlm etanol pa + 3% HCLO4 dlm
air), biarkan kering
2. Menyemprotkan H2SO4 10%, biarkan kering
3. Memanaskan diatas hot plate
4. Mengamati bercak

- Reagen Godin utk mendeteksi komponen yg tdk

terlihat pd kromatogram (menimbulkan warna pd
bercak)
- H2SO4 sebagai reduktor, mampu merusak gugus
kromofor zat aktif bergeser ke arah yg lebih
renggang (UV ke Vis) bercak tampak oleh mata
 N-heksana : etil asetat (4:1)

Dibawah sinar UV 254 Setelah diberi pereaksi

nm Godin

Fraksi n-heksana memberikan 4

Terdapat tailing (berekor) bercak dan paling jelas dibanding
kemungkinan karena penotolan fraksi lain major compound pd
terlalu pekat ekstrak ini berada di fraksi n-
heksana
 N-heksana : etil asetat (9:1)

Dibawah sinar UV 254 Setelah diberi pereaksi

nm Godin

Terdapat tailing (berekor)

Komponen terlihat lebih jelas = 4
kemungkinan karena penotolan
bercak/spot
terlalu pekat
5 Menghitung Rf
Menghitung Rf dengan rumus :
Nilai Rf : utk
identifikasi senyawa
(membandingkan Rf
senyawa murni dgn
Rf senyawa standar)
- Rf besar kepolaran
Nilai Rf sgt
rendah
karakteristik utk
- Rf kecil kepolaran
senyawa tertentu
tinggi
N-heksana : etil asetat (4:1)

NILAI Rf:
Rf1 = 1,6/3,5 = 0,45
Rf2 = 2,5/3,5 = 0,71
Rf3 = 2,9/3,5 = 0,82
Rf4 = 3,3/3,5 = 0,94

- Senyawa dgn Rf1 memiliki

afinitas terendah dgn fase gerak
- Senyawa dgn Rf4 memiliki
afinitas tertinggi dgn fase gerak
N-heksana : etil asetat (9:1)

Fraksi n-heksana memberikan 4

bercak

NILAI Rf:
1 = 1,25/3,5 = 0,35
2 = 2,3/3,5 = 0,65
3 = 2,75/3,5 = 0,78
4 = 3,2/3,5 = 0,91
KESIMPULAN
Fraksi rimpang temu ireng yang akan di purifikasi lebih lanjut (dg
kromatografi kolom) adalah fraksi n-heksana, karena menunjukkan
bercak paling banyak dan pemisahan paling jelas dibandingkan fraksi
etil asetat dan fraksi etanol
Major compound pd ekstrak temu ireng adalah senyawa yang
bersifat non polar
ISOLASI SENYAWA
MURNI DENGAN
METODE
KROMATOGRAFI
KOLOM
WAKTU DAN TEMPAT
Waktu : Selasa, 3 November 2015

Tempat : Lab PNA,Lt.3 Gedung FKIK UIN

Jakarta.
Alat dan Bahan
Bahan
Alat Ekstrak Sample (
Kolom Kromatografi Curcuma Aeroginosa
Erlenmeyer 500 mL L.)
Beker Glass Silica gel
N-heksana
Chamber
Etil Asetat
Lampu UV Etanol
Corong Kertas Saring
Vial Kapas
Lempeng KLT Aluminium Foil
Aquadest
Tujuan dan prinsip

Prinsip dari kromatografi

Tujuan dari kolom adalah
kromatografi kolom kecenderungan
agar dapat komponen/senyawa
mengetehaui kimia untuk terdistribusi
senyawa-senyawa ke dalam fase diam atau
yang tertarik fase gerak dengan
berdasarkan tingkat proses elusi
afinitas berdasarkan gaya
gravitasi dan tingkat
kepolaran.
Proses Kromatografi Kolom(www.ilmukimia.org).
Penyiapan
1 Kolom Kromatografi
Ditimbang silica gel
seberat 30 kali berat
Kolom ekstrak kental. Dimasukan
Kromatografi silica gel dalam becker
glass, ditambahkan
disiapkan dengan
aquadest sehingga bisa
memberi kapas menghasilkan silica
pada ujung kolom dengan konsistensi
untuk menahan seperti bubur, kemudian
aduk-aduk sampai
silica gel agar terbentuk suspensi,
tidak keluar. usahakan tetap diaduk
jangan sampai kering.

Ekstrak sampel Bubur silica yang telah tersuspensi

dimasukkan kedalam dimasukkan ke kolom kromatografi
kolom melalui bagian sedikit demi sedikit, sambil kolomnya
atas kolom dengan diketuk-ketuk perlahan,memasukkan
cara melarutkan pelarut n-heksan ke dalam kolom dan
ekstrak terlebih menampung pelarut yang turun,
dahulun dengan kemudian dimasukkan kembali ke
pelarut yang sesuai kolom. Lakukan secara berulang-ulang
dengan ekstrak. sehingga silica gel menjadi padat di
dalam kolom.
 Membuat
2 Sistem Pelarut

Pelarut dibuat dengan perbandingan antara pelarut nonpolar,semipolar

dan polar sehingga terjadi peningkatan polaritas (sistem gradient).
Pelarut yang digunakan :
n-heksana 100 % : 150 ml
n-heksana : Etil asetat (9:1) : 100 ml FUNGSINY
n-heksana : Etil asetat (8:2) : 100 ml
A APA?
n-heksana : Etil asetat (7:3) : 100 ml
n-heksana : Etil asetat (6:4) : 100 ml
n-heksana : Etil asetat (5:5) : 100 ml
n-heksana : Etil asetat (4:6) : 100 ml
n-heksana : Etil asetat (3:7) : 100 ml Agar dapat Mengetahui
senyawa-senyawa yang
n-heksana : Etil asetat (2:8) : 100 ml terkandung terdapat di
n-heksana : Etil asetat (1:9) : 100 ml pelarut
Etil asetat 100 % : 100 ml nonpolar,semipolar atau
campuran
3
Proses Isolasi
Masukkan pelarut n-
heksana 100 % ke dalam
kolom kromatografi sedikit
demi sedikit dengan
bantuan corong pisah,
buka kran kolom sehingga
pelarut tersebut akan turun
melalui kolom, tamping
hasil kolom yang keluar
dengan vial-vial yang diberi
nomor berurutan ( tiap vial
ditampung 10 ml) dan
ditandai nomer vial setiap
pergantian pelarut yang
digunakan.
Setelah pelarut n-heksan
100 % habis di dalam
kolom, ditandai dengan
hanya tinggal selapis
larutan diatas permukaan
sampel, maka tambahkan
pelarut dengan tingkat
kepolaran kedua yaitu
campuran n-heksana dan
etil asetat dengan
perbandingan 9 : 1
ditampung eluat yang
keluar sama dengan cara
sebelumnya
 3
Proses Isolasi
Setelah pelarut setelah dilakukan
campuran n-heksan dan sampai konsentrasi
etil asetat dengan pelarut etil asetat 100
perbandingan 9:1 habis % semua vial tutup
di dalam kolom, maka dengan aluminium
lanjutan dengan foil dengan diberi
penambahan pelarut udara kecil-kecil di
ketiga yaitu campuran sekeliling aluminium
n-heksan dan etil asetat foil yang sudah
8:2 dengan cara yang disediakan dan
dilakukan dengan cara dibiarkan menguap
1. dengan sendirinya.
Hasil
No Pelarut perbandingan Volume Nomor Vial
1 N-heksan murni 100 % 150 ml 1-10
:
2 N-heksan : Etil asetat 9:1 100 ml 11-17
3 N-heksan : Etil asetat 8:2 100 ml 18-26
4 N-heksan : Etil asetat 7:3 100 ml 27-33
5 N-heksan : Etil asetat 6:4 100 ml 34-39
6 N-heksan : Etil asetat 5:5 100 ml 40-46
7 N-heksan : Etil asetat 4:6 100 ml 47-54
8 N-heksan : Etil asetat 3:7 100 ml 55-63
9 N-heksan : Etil asetat 2:8 100 ml 64-71
10 N-heksan : Etil asetat 1:9 100 ml 72-78
1 Etil asetat murni 100% 100 ml 79-87
12 Etil asetat : etanol 9 :1 50 ml 88-91
 Pada praktikum kali ini yaitu
isolasi senyawa murni
dengan metode kromatografi
kolom dan sampel yang
digunakan adalah ektrask
temu ireng (Curcuma
aeroginosa L). Mula-mula
praktikan menyiapkan kolom
kromatografi dengan cara,
kolom kromatografi disiapkan
dengan memberi kapas pada
ujung kolom sebagai
penahan adsorben agar tidak
keluar bersama eluen
sebelumnya kolom
dibersihkan terlebih dahulu
agar tidak ada pengotor yang
menempel dan tidak terjadi
crack.
Kemudian ditimbang silica gel
(fase diam) 30 mg. Lalu
masukkan silica gel dalam
beaker dan di tambah
aquadest, aduk-aduk
sehingga menghasilkan silica
dengan konsistensi seperti
bubur. Bubur silica
dimasukkan kedalam kolom
sedikit demi sedikit sambil
diketuk-ketuk untuk
menghindari terjadinya
gelembung-gelembung udara
 Kolom yang padat
diindikasikan dengan warna Senyawa organik terelusi oleh
slurry (bubur) yang semakin eluen, proses elusi terjadi
memutih dan kecepatan alir karena keseimbangan
eluen yang semakin lambat. distribusi zat analit pada fase
Jika kolom sudah gerak n-heksan,etil
memadat, larutan sampel asetat,etanol dan fase diam
kemudian diisikan kedalam silika gel. Elusi terus
kolom . Mekanisme yang berlangsung hingga tidak ada
terjadi pada kromatografi lagi yang tinggal dalam kolom.
kolom ialah sample akan Proses elusi ini menghasilkan
terelusi oleh eluen (n- eluat yang diharapkan
heksan) melalui fase diam mengandung banyak senyawa
silika gel yang diinginkan
 Jika terdapat Setelah itu praktikan membuat
gelembung-gelembung system pelarut, pelarut dibuat
udara dalam kolom dengan perbandingan antara
maka akan berpotensi pelarut non-polar (n-heksan),
menyebabkan crack. semi polar (etil asetat) dan
Kran kolom dibuka, polar (etanol) sehinnga terjadi
pelarut yang keluar kenaikan polaritas (system
ditampung dan gradient) dengan
dimasukkan lagi ke perbandingan konsentrasi
kolom. Ekstrak yang sudah di tentukan
dimasukkan ke kolom terlebih dahulu.
dengan hati-hati.

Pergantian pelarut berikutnya harus dilakukan

segera setelah pelarut sebelumnya habis. Jika
tidak dilakukan secepatnya, silica dapat menjadi
kering dan rusak sehingga tidak dapat
memisahkan senyawa dengan baik.
Pelarut perbandingan Volume No Vial
N-heksan : Etil asetat 9:1 100 ml 11-17
N-heksan : Etil asetat 8:2 100 ml 18-26
N-heksan : Etil asetat 7:3 100 ml 27-33
N-heksan : Etil asetat 6:4 100 ml 34-39
N-heksan : Etil asetat 5:5 100 ml 40-46
N-heksan : Etil asetat 4:6 100 ml 47-54
N-heksan : Etil asetat 3 :7 100 ml 55-63
N-heksan : Etil asetat 2:8 100 ml 64-71
N-heksan : Etil asetat 1:9 100 ml 72-78

Kemudian jika pelarut sudah habis system gradient di lanjutkan

dengan pelarut ketiga yaitu dengan etil asetat 100%, dan ditingkatkan
kepolaran dengan pelarut etil asetat : etanol

Etil asetat : Etanol 9:1 50 ml 88-91

 Kelebihan kromatografi kolom :
- Dapat digunakan untuk analisa dan aplikasi preparatif
- Digunakan untuk menentukan jumlah komponen
campuran
- Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

Kekurangan kromatografi kolom :

- Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan
teknik dan manual.
- Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time
consuming)
Kesimpulan
Kromatografi kolom yaitu purifikasi atau isolasi
senyawa campuran.
Isolasi yang dilakukan yaitu dengan system gradient
(peningkatan polaritas)
Isolasi yang dilakukan dengan menggunakan
sampel Curcuma aeroginosa L.
Pelarut yang digunakan N-heksan ( Nonpolar ), Etil
Asetat ( Semipolar), Etanol ( Polar )
Pergantian pelarut terdapat pada vial 1-10 n-heksan
murni, vial 11-26 fraksi n-heksan dan etil asetat, vial
79-87 etil asetat murni, vial 88-91 fraksi etil asetat
dan etanol,
 Klt Fraksi

TUJUAN
Pemisahankomponen kimia dengan metode
kromatografi lapis tipis (KLT)terhadap
beberapa fraksi

PRINSIP
Prinsip klt fraksi sama dengan klt biasanya
Alat dan Bahan
Alat Bahan
Chamber Ekstrak temu ireng
Gelas ukur yang telah dikolom
Penutup chamber Larutan n-Heksan

Lampu UV Larutan etilasetat

Lempeng klt
Kertas saring
Pinset
Pensil
Penggaris
 Pengelompokan ekstrak yang
1.
telah dikolom

Pengelompokkan ekstrak hasil kolom kromatografi yang telah diuapkan

selama 1 minggu dan ditentukan vial yang akan digunakan untuk proses
klt fraksi secara acak .

Untuk mengetahui senyawa dominan yang terlarut oleh

pelarut yang sesuai.
 Pembuatan batas pada lempeng
2.
klt

Membuat batas atas dan bawah pada lempeng klt dengan batas bawah 1
cm dan batas atas 1 cm

Untuk mengetahui batasan atas agar eluen yang melarutkan ekstrak tidak melebihi
batas atas. Fase diam yang digunakan adalah silica GF254 .
-Silika gel : tdk bereaksi dgn pereaksi2 yg lebih reaktif (H2SO4)
- Mekanisme sorpsi : Adsorpsi
- GF254 : Gypsum sbg pengikat + berfluoresensi pd 254 nm
- Bersifat polar senyawa polar terjerap lebih kuat
3. Penjenuhan larutan eluen

Mengambil sebanyak 9 ml larutan n-heksan dan 1 ml larutan etil asetat

dan dicampurkan ke dalam chamber dan memasukkan kertas saring
untuk menjenuhkan larutan eluen tersebut.

Pemilihan larut an eluen berdasarkan dari hasil klt yang diperoleh

sebelumnya. Dimana eluen dengan perbandingan n-heksan (9) : etil
asetat (1) memiliki nilai Rf yang baik dengan kisaran 0,2 -0,8,bila
dibandingkan dengan perbandingan n-heksan (4): etil asetat (1) .
4. Melarutkan Ekstrak

Melarutkan ekstrak dengan pelarut yang sesuai.

Supaya ekstrak menjadi larutan cuplikan (sampel) untuk

ditotolkan pada plat KLT
5. Penotolan ekstrak

Menotolkan sampel pada plat KLT pada batas bawah dengan pipa kapiler

- Menotolkan dg ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin

menghindari pelebaran bercak & meningkatkan resolusi
- Pelebaran bercak mengganggu nilai Rf (akan ada himpitan puncak)
- Penotolan dilakukan 1-2 totol dgn pengeringan antar totolan
6. Proses Pengembangan Sampel

Klt yang telah ditotolkan dimasukkan kedalam chamber yang telah di

jenuhkan . Dan mengeluarkan plt KLT dari chamber setelah eluen mencapai
batas atas .

- Tinggi fase gerak harus dibawah tepi bawah garis plat KLT
- Selama proses elusi, chamber kromatografi harus ditutup rapat
 Melihat hasil dengan
7.
menggunakan lampu UV

Hasil yang diperoleh setelah melakukan penjenuhan dengan

menggunakan eluen dapat dilihat dengan menggunakan
lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm.

-Sinar UV 254 nm lempeng berfluoresensi kehijauan, sampel gelap

- Penampakan bercak : interaksi sinar UV-indikator fluorensensi pada lempeng
8. Menghitung Rf

Menghitung Rf dengan rumus :

- Nilai Rf : utk identifikasi senyawa (membandingkan Rf senyawa murni

dgn Rf senyawa standar) .
- Nilai Rf sgt karakteristik utk senyawa tertentu.
- Rf besar kepolaran rendah .
- Rf kecil kepolaran tinggi.
Nilai Rf
No.17 nilai Rf1 =0,242
No.17 nilai Rf2 = 0,714
No.21 nilai Rf = 0,457
Nilai Rf
No 23 nilai Rf = 0,214
No 25 nilai Rf = 0,171
No 27 nilai Rf = 0,071
No 29 nilai Rf = 0,071
Kesimpulan
Kami memutuskan menggunakan no 17 untuk
dilanjutkan ke proses klt perparatif dengan pertimbangan
sebagai berikut :
1.Pada no 17 memiliki hasil klt fraksi yang dilihat dari
lampu uv dengan panjang gelombang 254 nm memiliki
pola pemisahan yang baik dan bentuk yang besar.
Sehingga kami menduga bahwa fraksi no 17
mengandung senyawa yang dominan.
2. Nilai Rf dari no 17 menunjukan hasil yang baik yaitu nilai
Rf terletak antara 0,2- 0,8 untuk memaksimalkan proses
pemisahan
3. Dengan menggunakan fraksi pada no 17 diharapkan
dapat mengisolasi senyawa yang lebih murni.
 Pemurnian dengan
kromotografi preparatif
Kromotgorafi preparatif
KLT preparatif adalah isolasli
senyawa berdasarkan adsorbsi serta
kelarutan dari senyawa kimia yang TUJUJAN
mengikuti fase gerak.

Untuk KLT Preparatif dapat

digunkaan untuk memisahkan bahan
dalam jumlah gram, namun sebagian
besar pemakaian hanya dalam KLT preparatif adalah untuk
jumlah milligram (Kristanti, 2008) memisahkan komponen
campuran yang akan digunakan
Seperti pada kromotgrafi pada untuk analisa lanjutan hingga
umumnya, Kromatografi preparatif didapatkan fraksi murni
juga menggunakan fase diamnya
adalah sebuah plat dengan ukuran
ketebalan bervariasi. dengan
adsorben silika gel atau aluminium
oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan
tebal 1 mm (Kristanti,2008)
 alat bahan

gelas erlenmayer, plat kaca,

Chamber, Pipet kapiler , Pipet
Sillica gel GF254 ,Aquades, n-
teters, Kapar , Alumenium Foi, plat
heksan, metil asetat
kaca dan Lampu UV
 Pembuatan fase
diam
Pembuatan plat silica
dilakukan untuk
digunakan sebagai fase Silica gel 30
diam, Aquades 60 ml
gram
Kocok kuat
Silica yang digunakan ,
silica GF 254. yang
memiliki flurosen yang Suspensi silica gel
berpendar pada sinar
UV 254. Tuangkan , ratakan

Sebelum dipakai silica Suspensi pada plat

yang telah kering diberi kaca
batas atas atau batas
bawah menggunakan
pensil Keringkan

Plat silica
Pembuatan pelarut

Pembuatan pelarut n-heksan : etil asetat untuk melarutkan vial dari fraksi no
17
PENJENUHAN CHAMBER
Chamber yang digunakan sebagai wadah fase gerak dijenuhkan,
menggunakan pelarut n-heksan : etil asetat (9 : 1) sebanyak 100 ml.
bejana yang digunakan biasanya dilapisi dengan kertas saring dan
Bejana chamber selama proses penjenuhan harus tertutup rapat

. Chamber yang dikatakan jenuh apabila fase gerak telah mencapai

uung kertas serang (Gandjar, 2007). Penjenuhan dilakukan untuk
mempercepat proses elusi.
Penotolan sampel
Fraksi nomor 17 yang telah
dilarutkan menggunakan Penotolon fraksi pada plat
pelarut n-heksan : etil asetat , dengan arah memanjang ,
ditotolkan pada silica gel yang mengikuti garas pembatas
telah diberi batas atas dan
bawah

Pada proses penotoloan dilakukan dengan arah memanjang, untuk mengetahui

pembentuk pita akan sama (senyawa yang sama) dan mendapatkan senyawa
yang dielusi dalam jumlah banyak,
Pemisahan
Plat KLT yang telah ditotolkan
fraksi , dimasukan dalam
chamber yang telah jenuh.
Dan amati pergerakan eluent,
hingga mencapai garis batas
atas.
Deteksi Bercak
Setelah pergerakan fase gerak
mencapai batas atas dari garis
pembatas,
Amati pita yang terbentuk pada sinar
UV. Terbentuknya 1 pita yang
memanjang.
Pita yang terbentuk dikikis
menggunakan spatula.

Pada pengamatan melalui sinar uv Tampak

1 pita biru memanjang dibawah sinar uv
365
Noda yang tampak pada uv 365, adanya
flourosensi dari senyawa tersebut yang
mengadsorbsi sinar uv

Silica yang telah dikikis
Digerus
Bubuk silica
Masukan dalam pipet tetes
Yang telah terisi kapas
Aliri dengan etil asetat
Fraksi etil asetat
Silica yang telah dikikis untuk mendapatkan Senyawa yang
terdapat pada silica
Digerus menjadi bubuk, agar lebih mudah dalam Proses
memasukan dalam pipet tetes dan Senyawa yang tertahan
dalam silica akan dibawa oleh pelarut.
Penggunaan Kapas digunakan untuk menahan silica agar tidak
lolos keluar bersama pelarut.
Dialiri dengan etil asetat untuk memisahkan senyawa yang
berada dalam silika, sehingga terjadi pemisahan silika dengan
senyawa. Pada pemisahan digunakan etil asetat yang semi
polar, sehingga mudah menarik senyawa nonpolar dan semi
polar, tidak digunakan senyawa polar seperti etanol dan
metanol , kemungkinan dapat melarutkan silica yang sifatnya
polar.
 Analisa kualitatif untuk meyakinkan
Analisa kualitatif KLT Fraksi yang telah diisolasi hanya
menarik Senyawa yang telah murni.

Fraksi etil larutkan 1 spot yang terbentuk digunakan untuk

Etil asetat
asetat mengetahui senyawa yang diisolasi
Totolkan telah murni.

Untuk mengetahui lebih lanjut dari

silica beri senyawa murni yang didapat. Dapat
batas atas dan dilakukan analisa lanjutan dengan
batas bawah analisa lain seperti spektrofotmetri

masukan

Chamber eluent n-heksan : etil asetat

(jenuh)

Amati bercak yang

terbentuk pada sinar UV Terbentuk 1 spot
254
Kesimpulan
Pada proses kronotgrafi preparatif , dari fraksi
vial nomor 17 didapatkan 1 pita biru
Analisa kualitatif menggunakan KLT , terlihat 1
spot yang menandakan fraksi yang didapat
bersifat murni