Marker Assisted Selection

(MAS)

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Seleksi menggunakan
observasi fenotipik

Dukungan statistika yang

rumit dalam menyeleksi

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 1. Bersifat stabil dan
Pemuliaan Molekuler dapat terdeteksi
pada semua
jaringan
2. Tidak dipengaruhi
olh faktor
lingkungan
3. Tidak memiliki efek
pleiotropi atau
Penanda Genetik epistasis
kelebihan 4. Menungkinkan
studi individu pada
tahap dini

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 PENANDA GENETIK

Merupakan penanda berupa sekuens DNA atau protein yang secara

langsung dapat dideteksi dan pewarisannya dapat dimonitor

Francis Crick (1958) mengemukakan teori Central Dogma

DNA RNA Protein

mRNA yang berasal dari DNA akan menghasilkan enzim

Fenotipe merupakan produk dari enzim, sehingga enzim
dapat digunakan sebagai penanda genetik
Pengantar Pemuliaan Tanaman
 Genetic Marker

C B A

B A
DNA Markers

Isozyme Markers

Visual Markers
 Gene structure

Start site Transcribed region Poly A tailing site

Termination site
regulator promoter

EXON INTRON EXON AAUAA

TATA

UTR ORF UTR

AUG UGA,UAA,UAG

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Genetic Marker
Criteria for genetic marker

1. The trait must differentiate between parents

2. The trait must be reproduced accurately in
the progeny

Cases
a. Flower color distinguishable between two parents
and the parental color accurately reproduced in
the progeny
b. Plant height is often different two parents, but
not accurately reproduced in the progeny
 Genetic Marker
Dominant marker
Classification Co-dominant marker

aa Aa AA aa Aa AA

tm/tm Tm/tm Tm/Tm

Dominant marker only marks

Co-dominant marker be able
presence of the locus, and
to differentiate homozygous
cant differentiate between
locus as well as heterozygous
homozygous & heterozygous
locus
 Genetic Marker

Isozyme Markers

Isozymes (Penanda berbasis protein)

Enzim yang mempunyai bentuk polimorfik
dalam suatu organisme atau spesies tanaman
yang sama tetapi mengkatalisator reaksi
metabolisme yang sama

Polimorfisme isozim (isoenzim) berupa molekul-molekul protein

berbeda yang fenotipenya dapat ditampakkan dalam bentuk pita-pita
dan pola pita yang berbeda dengan menggunakan gel elektroforesis
yang diwarnai dengan pewarna yang spesifik untuk setiap enzim

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Struktur Isozymes:
1. Monomeric enzyme (shikimate dehydrogenase, aconitase)
Mudah membedakan antara homozigot dan heterozigot
2. Dimeric enzyme (malate dehydrogenase, aspartate
aminotransferase, glucose phospate isomerase)
Heterozigot mempunyai pita-pita lain yang mencirikannya
3. Multimeric (glutamate dehydrogenase, menadione
reductase)
Ada tambahan pita yang lebih banyak pada heterozigot

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Kelebihan isozim:
Memperlihatkan pola pewarisan mendelian
Ekspresi kodominan
Isozim adalah protein, maka isozim akan mencerminkan langsung
kalau terjadi perubahan dalam sekuen DNA melalui perubahan
komposisi asam aminonya

Karakteristik isozim
Produk dari alel yang berbeda bergerak pada posisi yang
berbeda pada gel
Alel yang berbeda, biasanya diwariskan secara kodominan,
bebas dari epistasis sehingga dapat membedakan homozigot
dan heterozigot

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 DNA Marker

Site classification
Random Markers
1. Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)
2. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
3. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
4. Simple Sequence Repeat (SSR)/Microsatellites

Specific Markers
1. Sequence Characterized Amplification Region (SCAR)
2. Expressed Sequence Tags (EST)
3. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Technique classification for DNA marker

a. Hybridization based markers

b. PCR based markers
c. PCR based markers followed by hybridization
d. Sequencing and DNA chip markers

A. Hybridization based markers

1. Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP).
Polymorphism arise due to base substitution, insertion, deletion
and translocation, as detected by probe and restriction enzymes.

2. Dispersed Repetitive DNA (drDNA). Polymorphism arise

due to variable number of tandem repeats, as detected by probe
of minisatellites or microsatellites and restriction enzymes.

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 B. PCR based markers

1. Single Primers PCR methods

a. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
b. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR)

2. PCR methods using Pair of Primers

a. Sequence Characterized Amplification Region
(SCAR), Sequence Tagged Sites (STS)
b. Simple Sequence Repeat (SSR)/Microsatellites
c. Expressed Sequence Tags (EST)
d. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
e. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Pengantar Pemuliaan Tanaman
 C. PCR based markers followed fragment restriction
Cleaved Amplified Polymorphism (CAPs) marker. In this
approach genomic DNA amplified PCR and followed by
fragment cutting with Restriction Enzymes. Polymorphism
arise due to differences of single base in the restriction site
D. Full sequence based DNA markers
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Polymorphism
arise due to differences of single base, as detected in equal
length of DNA fragments.

Atf1:1 TGAATGCTAGCTGGCTGAATTTTGGCAGTAAGT 28
************ ********************
Atf2:1 TGAATGCTAGCTTGCTGAATTTTGGCAGTAAGT 28
************** ******************
Atf3:1 TGAATGCTAGCTGGATGAATTTTGGCAGTAAGT 28

Pengantar Pemuliaan Tanaman

Markers comparison
Teknik PCR (Reaksi berantai polimerase)

Teknik PCR merupakan metode analisis untuk mencari marka

molekul melalui pengulangan siklus DNA
Tidak memerlukan contoh DNA banyak (Pengulangan siklus 25-50
kali akan meningkatkan jumlah fragmen DNA yang diamplifikasi)
Reaksi berantai polymerase dilaksanakan dalam mesin PCR

Teknik PCR didasarkan pada prinsip amplifikasi sekuen DNA secara

enzimatis yang melibatkan pengaturan temperatur pada mesin PCR selama
pengulangan siklus.

3 tahapan dalam PCR

Denaturasi DNA menjadi utas tunggal pada suhu 94oC
Annealing, merupakan penempelan primer pada sekuen DNA (25oC 65oC)
Elongation, perpanjangan primer pada suhu 72oC (elongation, dilakukan
oleh enzim DNA polimerase)
Double strand DNA
Denaturation

Single strand DNA

Annealing

Primer attachment

Extension
Double strand DNA
Taq polymerase syntheses a new DNA strand
Double strand DNA
First Cycle Second Cycle Third Cycle
AGTCTTAACAGTC
TCAGAATTGTCAG
AGTCTTAACAGTC
AGAATTGTC AG

AGTCTT AACAG
TCAGAATTGTCAG
AGTCTTAACAGTC
AGAATTGTCAG
AGTCTTAACAGTC
AGAATTGTC AG
TC T TA ACAG
AGAATTGTCAG
TCTTAACAG
AGAATTGTCAG
TCTTAACAG
AGAATTGTC
TCTTA ACAG
AGAATTGTCAG
AGTCTT AACAG
TCAGAATTGTCAG
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)

Amplifikasi suatu fragmen DNA tertentu memakai

sepasang primer spesifik sehingga menghasilkan
fragmen yang dimaksud.

Hasil amplifikasi dipotong memakai enzim restriksi dan

akan menghasilkan potongan fragmen yang panjangnya
dapat bervariasi tergantung pada keberadaan situs restriksi
yang ditemukan

Situs pemotongan bisa berupa: Blunt end (tumpul)

Sticky end (lancip)

 Beberapa contoh enzim restriksi

Sumber Enzim RE Sekuen pengenal dan Tipe ujung

situs pemotongan pemotongan

Arthobacter AluI 5A-G / C-T3 Tumpul

luteus 3T-C / G-A5
Bacillus BamHI 5G / G-A-T-C-C3 Lancip
amyloliquefaciens 3C C-T-A-G/G5
H
Escherichia coli R EcoRI 5G /A-A-T-T-C3 Lancip
3C T-T-A-A /G5
Haemophilus HaeIII 5G-G / C-C3 Tumpul
aegyptius 3C-C / G-G5

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Prinsip dasar penggunaan RFLP dalam mensintesis DNA untuk kegiatan
mapping, karakteristik, dll, karena adanya polimorphisme sehingga
bisa membedakan individu

Polimorphisme, terjadi karena;

Situs pemotongan mengenali tempat pemotongan pada fragmen
tertentu sehingga DNA terbagi dan ukurannya tidak sama panjang
Jika pada utas DNA terjadi mutasi titik maka situs pemotongan
akan mencari tempat yang lain sehingga bisa saja utas DNA
pemotongan pertama tidak sama dengan pemotongan kedua
Jika pada utas DNA terjadi delesi maka akan terjadi
pengurangan kromosom sehingga potongan DNA menjadi pendek
Jika pada utas DNA terjadi insersi/sisipan maka akan terjadi
penambahan DNA dan potongan DNA menjadi panjang

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)

Metode analisis untuk mencari marka molekul DNA yang

menggunakan PCR dengan primer-primer acak
oligonukleotida pendek sebagai pembuat marka molekul

RADP memerlukan penyeleksian primer acak yang memberikan

hasil polimorphisme
Metode RAPD memerlukan elektroforesis gel agarose dalam
memisahkan fragmen DNA hasil PCR dan pita RAPD nya
ditampakkan dengan pewarnaan etidium bromide yang dilihat
diatas lampu sinar UV
Jika RAPD menggunakan gel poliakrilamida dan pewarnaan perak
nitrat, disebut DNA Amplification Fingerprinting (hasil DNA lebih
tajam dan jelas karena resolusi gel tinggi
 Ditemukan oleh William et al. (1980)
RAPD mengunakan single short primer (10 basa)
Akan terjadi penempelan pada DNA yang akan diuji pada tempat-
tempat yang dikenali diseluruh genom
Primer menempel pada strand yang berlawanan

Amplifikasi bisa gagal terjadi karena:

a. Tidak menemukan tempat substitusi dan penempelan dengan primer
b. Terjadinya delesi pada primer binding site
c. Terjadi insersi antara 2 primer binding site

Pengantar Pemuliaan Tanaman

Contoh primer dengan sekuensnya:

Primer sequens (5 3)
AN 03 AGCCAGGCTG
AN 05 GGGTGCAGTT
AN 06 GGGAACCCGT
AK 12 AGTGTAGCCC
Pola PITA pada RAPD AA AA AA

Lokus 1

Lokus 2

Pola PITA pada RFLP AA AA AA

Alel 1

Alel 2
 Alasan memilih RAPD:
a. Hanya butuh sedikit DNA
b. Tidak memerlukan info sekuens
c. Tidak ada penggunaan radioaktif
d. Mudah dan murah

Pengantar Pemuliaan Tanaman

 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

Sistem penanda yang merupakan gabungan antara

spesifitas sistem penanda RFLP dengan RAPD

3 langkah utama dari AFLP

a. Restriksi DNA dan ligase adapter
b. Amplifikasi secara selektif dari fragmen DNA
c. Analisis gel

Pengantar Pemuliaan Tanaman

bp M 1 2 3 4 5 6 7

Dendrogram