Analisa Produk

Rekombinan
Putu Yustiantara
 Metode deteksi
Metode berbasis asam nukleat (DNA/RNA)
Metode berbasis protein
 Amplifikasi DNA target
dalam genom organisme
 DETEKSI GEN REKOMBINAN
Deteksi kimia fisik
Spektrofotometer
Elektroforesis gel agarosa
Kebenaran ukuran
DNA sekuensing
Kebenaran urutan nukleotida (DNA sekuenser
otomatis)
 Quantifying DNA: Spectrophotometry

Maximum absorption of
DNA at 280 nm
Convert absorption to
OPTICAL DENSITY (OD)
OD = absorption X dilution
factor
1 OD = 50 mg dsDNA per ml
Generally need large Images from Wikipedia
sample size
 Gel electrophoresis
A method of separating DNA
in a gelatin-like material using
an electrical field
DNA is negatively charged
when its in an electrical field it
moves toward the positive side

DNA

+
Produk DNA Pewarnaan
rekombinan DNA:
ethidium
bromide
binds to
DNA
fluoresces
under UV
light
-

power
source

+
 Gel Agarose
Most agarose gels are made between 0.8% and 2%.
A 0.8% gel will show good resolution (separation)
of large DNA fragments (5-10 kb)
A 2% gel will show good resolution for small
fragments (0.2-1kb)
Low percentage gels are very weak and may break when you
try to lift them.
High percentage gels are often brittle and do not set evenly.
 What is needed?
Buffer - either TBE or TAE
The buffer provides ions
in solution to ensure
electrical conductivity
Not only is the agarose
dissolved in buffer, but the
gel slab is submerged
(submarine gel) in buffer
after solidifying
Also needed are a power
supply and a gel chamber
 DNA ladders/markers

Frequently, one of
the wells in your gel
will contain a DNA
ladder
This is used as a
marker to compare
the sample DNA
fragments and
estimate their sizes
Contoh deteksi DNA: Hasil transformasi (sel dilisis)
1 2 3 4 5 6 7 8
Cat:
Transformasi ke-1
awalnya gagal
karena
DH5_pjx_ctrl
Tidak ada yang
tumbuh pada ink.
O.N.

Ket:
1 = pJx_ctrl transf.ke-1 (resque) 7 = pJx_ctrl klon1 transf. ke-2
2 = pJx ctrl transf.ke-1 (stlh 48jam ada koloni) 8 = pJx_cgtase klon 1 transf. ke2
3 = pJx_cgtase klon 1 transf. ke-1
4 = pET 16_bmp2 (kontrol +) Kesimpulan:
5 = pJx ctrl klon 2 transf. ke-1 Sumur 7 dan 8 Dipilih untuk isolasi plasmid,
6 = pJx_cgtase klon 2 trans. Ke-1 karakterisasi, dan transformasi ke BL21
 Sequencing
Sanger method (dideoxy)
4 Steps:
1. Denaturation
2. Primer attachment and extension of
bases
3. Termination
4. Gel electrophoresis
Overview: Dideoxy (Sanger) Method
2
3

1
4

Gel
electrophoresis
5
 Dideoxy (Sanger) Method
ddNTP- 2,3-
dideoxynucleotide
No 3 hydroxyl
Terminates chain when
incorporated
Add enough so each
ddNTP is randomly and
completely incorporated
at each base
Automated Version of the Dideoxy
Method
METODE BERBASIS PROTEIN
 Karakterisasi protein :

Berdasarkan :
- bobot molekul : SDS-PAGE
- muatan : Isoelectric focusing
- reaksi imunokimia : Western blot, ELISA
 SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis

Protein didenaturasi SDS
Tujuan : protein memiliki struktur yang seragam
Struktur linier
Protein bermuatan negatif
Pada medan listrik : protein bermigrasi ke kutub positif
Jarak migrasi berdasarkan berat molekul
Membutuhkan media berpori gel poliakrilamid
 Gugus R bermuatan

Sebelum ditambah SDS

daerah hidrofob

Setelah ditambah SDS

Persentase Resolusi
akrilamid pemisahan
15% 15 45 kD
12,5% 15 50 kD
10% 18 75 kD

7,5% 30 120 kD
5% 60 212 kD
A. Pembuatan separating gel
B. Pembuatan stacking gel
Chemsrv0.pph.univie.ac.at/methods.htm
 Contoh hasil SDS-PAGE

205 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa

Pewarnaan dengan Coomassie blue Silver stain

Batas deteksi :
Coomassie : 36 - 47 ng
Silver : 0,5 - 1,2 ng
 Native-PAGE
Tanpa penambahan SDS
Protein tidak terdenaturasi
Non-denaturing PAGE
Migrasi protein pada gel berdasarkan konformasi protein
 Isoelectric focusing

Karakterisasi protein berdasarkan muatan total

Menggunakan gel poliakrilamid
Elektroforesis dengan gradien pH antara katoda dan anoda
menggunakan larutan amfolit
Titik isolelektrik (pI) : pH dimana muatan total protein adalah nol
Muatan total nol protein tidak bermigrasi pada medan listrik
ASAM AMINO
 IEF

www.food.rdg.ac.uk/online/fs460/lecture4/lecture4.htm
 IEF

Normal Asp (asam)

N C

Mutan Arg (basa)

N C

Mutan Glu (netral)

N C
Alat isoelectric focusing
 Elektroforesis dua dimensi
Gabungan dari IEF dan SDS-PAGE
Digunakan untuk karakterisasi protein dengan berat molekul
sama tetapi muatan berbeda
Konfirmasi kemurnian protein

Dimensi pertama : isoelectric focusing

Dimensi kedua : SDS-PAGE
Elektroforsis dua dimensi (2D-SDS-
PAGE)

IEF SDS-PAGE
Contoh hasil 2D-SDS-PAGE
 ELEKTROFORESIS

KEMURNIAN DAN HOMOGENITAS

SDS-PAGE (DENATURASI): AGREGASI, OKSIDASI, DEAMINASI
NATIVE-PAGE: AGREGASI, OLIGOMERISASI
KONTAMINAN
STABILITAS PROTEIN: PERUBAHAN ASAM AMINO,
HOMOGENITAS, DEAMINASI GLUTAMIN & ASPARAGIN (LEBIH
ASAM)
GLIKOSILASI (ASAM SIALAT)
 KARAKTERISASI STRUKTUR
PRIMER PROTEIN

SEKUENSING UJUNG
AMINO (10-15 asam amino
pertama)

SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI

PEMETAAN PEPTIDA
(Peptide mapping)
 SEKUENSING UJUNG SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI (C-terminal)
AMINO (N-terminal)

C
N

PEMETAAN PEPTIDA

Metode Sequencing
protein
 KEGUNAAN PEPTIDE MAPPING
IDENTITAS
KONFIRMASI STABILITAS GENETIK
KONSISTENSI LOT KE LOT
PEPTIDE TERGLIKOSILASI (MAB)
ASAM AMINO YANG SALAH (1 ATAU >1)
 Prinsip Western Blot
Karakterisasi protein berdasarkan reaksi antigen - antibodi
Mampu mendeteksi satu protein dalam campuran
Dapat memberikan informasi mengenai MW protein
menggunakan rainbow marker
Diperlukan antibodi yang spesifik mengenali protein
target antibodi primer
Antibodi sekunder dikonjugasi dengan enzim tertentu
Contoh : horseradish peroxidase, alkalin fosfatase
 warna ungu
+ Nitro blue tetrazolium (NBT)
Protein ditransfer ke
AP + 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phospate (BCIP)
membran nitroselulosa SDS-PAGE
Ab 2o
Ab 2o
Ab 1o
Protein target

Membran nitroselulosa

Dilabel dengan Visualisasi

antibodi spesifik
Contoh rainbow marker
Contoh hasil Western blot
TERIMA KASIH
Modifikasi PCR
 PCR MULTIPLEKS
PCR multipleks adalah suatu PCR yang menggunakan primer > 1 pasang
yang mengenali fragmen target yang berbeda. Sebagai contoh untuk
mendeteksi berbagai galur Escherichia coli yang mempunyai 7 gen target
berbeda (gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2 dan VTE). Oleh karena itu
dibutuhkan 7 pasang primer yang masing-masing secara spesifik
mengenali ke7 gen target tersebut. Jika semuanya teramplifikasi, maka
akan dihasilkan 7 produk PCR. Persyaratan untuk PCR multipleks adalah
ke7 primer tersebut harus menempel pada kondisi yang sama dan ke7
produk PCR tersebut mempunyai ukuran berbeda sehingga dapat
dibedakan pada saat elektroforesis.
 HASIL PCR MULTIPLEKS
S A B C D

LT1

ST1

SLT1
SLT2
VT1
VT2
VTE

Slide menunjukkan simulasi PCR multipleks. Pada S: semua gen target teramplifikasi
dan ada 7 produk PCR dengan ukuran yang berbeda. Pada A: sampel mengandung
LT1, SLT1 dan VT2. Pada B: sampel mengandung ST1 dan VT2. Pada C: sampel
mengandung ST1, SLT1, SLT2, VT1 dan VTE. Pada D: sampel mengandung LT1 dan
VT1.
 Nested-PCR
GEN FLAGELIN S. typhi
ST1

ST2
PCR pertama
ST3
458 pb
ST4
PCR kedua

343 pb
 Nested PCR
Nested-PCR menggunakan > 1 pasang primer tetapi untuk gen target yang sama.
Perhatikan bedanya dengan PCR multipleks. Pada slide ini, gen target yang
digunakan untuk deteksi Salmonella typhi adalah gen flagelin. Primer yang
digunakan ada 4 yaitu ST1, ST2, ST3 dan ST4. Nested-PCR melibatkan 2 kali PCR.
Pada PCR pertama digunakan primer ST1 dan ST2 (primer eksternal) dan
menghasikan produk PCR berukuran 458 pb. Sebagian kecil produk PCR pertama
diambil untuk digunakan sebagai cetakan pada PCR kedua. PCR kedua
menggunakan ST3 dan ST4 (primer internal). Karena ST3 dan ST4 mengenali
urutan pada produk PCR pertama di bagian internalnya, maka produk PCR kedua
mempunyai ukuran yang lebih kecil dari produk PCR pertama. Apa keunggulan
nested-PCR? Karena primer yang digunakan ada 4 (2 pasang) maka spesifitas
dengan nested-PCR akan meningkat. Bila dalam spesimen terdapat inhibitor yang
dapat menghambat Taq (sehingga PCR tidak berjalan), maka akan memberikan
hasil negatif palsu. Pada PCR pertama ke PCR kedua terjadi pengenceran sehingga
inhibitor dapat terencerkan. Pada kasus seperti ini, biasanya produk PCR pada PCR
pertama tidak tampak pada elektroforesis tetapi pada elektroforesis kedua produk
PCRnya muncul
 Reverse Transcription (RT) PCR

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Molekuler-FA6023 Diagnostik Molekuler 47

PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRI

lisis

PCR

deteksi kolorimetri
molekul target sinyal denaturasi

hibridisasi
substrat
 DETEKSI KOLORIMETRI

TMB
H2O2

Horse radish peroxidase

Avidin

Biotin
Produk PCR

Pelacak
END-POINT DETECTION
DAERAH DETEKSI REAL-TIME PCR