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QUIMIOLUMINISCENCIA

FUNDAMENTO
TIPOS
PRUEBAS
APLICACIN CLNICA
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
FUNDAMENTO

La Quimioluminiscencia es la produccin de
luz a partir de una reaccin qumica. Dos
compuestos qumicos reaccionan para formar
un intermediario en estado excitado (alta
energa), que se desexcita liberando parte de
su energa como fotones.
TIPOS DE QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA (DIRECTA)
Una tcnica basada en la quimioluminiscencia, la cual emplea como fase slida, micropartculas paramagnticas
recubiertas de anticuerpos especficos contra la sustancia a analizar.
Este ensayo es de tipo heterogneo y, se caracteriza por la emisin de luz visible debido a una reaccin qumica
producida por una oxidacin empleada. Se realizan ensayos tanto por competencia como por sandwich .
QUIMIOLUMISCENCIA AMPLIFICADA (INDIRECTA)
El cual emplea como marca una enzima, que cataliza la hidrlisis del substrato (el cual es un compuesto
estable) para formar constantemente un anin inestable el cual produce una fuerte emisin de luz. Esta
seal luminosa prolongada en lugar del relmpago de luz de los otros mtodos quimioluminiscentes
permite hacer numerosas lecturas con el consiguiente aumento en la precisin del ensayo.
MARCAJE ABEI

ABEI es un derivado de isoluminol.


Nombrequimico: N-(4-Aminobutilo)-N-etilisoluminol
NANO-MICROESFERAS
Estan formadas por:
Polimeros organicos en la capa externa
y
Oxido de hierro (tamano de nano) en el nucleo
Las microesferas estan dotadas de superparamagnetismo,
sobre la base de nano material de oxido de hierro
Buena suspension, reaccion homogenea, reduce el volumen de
la muestra, aumenta eficacia de reaccion
Superparamagnetismo, separacion completa
No hay remanente magnetica, totalmente re-suspenso, mejorar
la sensibilidad
MARCADOR FITC

Isotiocianato de fluoresceina (FITC) es un derivado de fluoresceina


se utilizan como un puente para conectar ABEI y las microesferas.
PROCALCITOTINA

Es el propeptido hormonalmente inactivo de la calcitonina, Dado que la PCT se


descompone por proteolisis en individuos con un metabolismo normal, los niveles
de PCT suelen ser indetectables (< 0,1 ng/mL). En infecciones graves provocadas
por bacterias, hongos y parasitos, asi como en la septicemia, los niveles de PCT
en suero pueden aumentar hasta alcanzar mas de 500 ng/mL. En la actualidad se
considera que la sintesis de procalcitonina en condiciones de respuesta
inflamatoria sistemica tiene lugar, entre otras, en las celulas sanguineas
mononucleares.
Las evaluaciones clinicas en diferentes campos:
- para efectuar un diagnostico temprano de infeccion bacteriana o micotica
generalizada y de septicemia
- para evaluar la gravedad y pronosticar la evolucion de infecciones sistemicas,
septicemia y fracaso multiorganico
- para vigilar el desarrollo de infecciones en pacientes de alto riesgo, p.ej. despues
de una intervencion quirurgica o un trasplante de
El metodo para la determinacion cuantitativa de PCT es un inmunoensayo de quimioluminiscencia en sandwich.
Las particulas magneticas (fase solida) estan recubiertas con un anticuerpo monoclonal murino especifico;
otro anticuerpo monoclonal esta ligado a un derivado de isoluminol (conjugado de isoluminol-anticuerpo).
Durante la incubacion, las muestras se liga al anticuerpo monoclonal en fase solida, tras lo que el conjugado
de anticuerpo reacciona con la PCT ya ligada a la fase solida.
Despues de la incubacion, se elimina el material no enlazado mediante un ciclo de lavado.
A continuacion, se anaden los reactivos starter que inducen una reaccion de quimioluminiscencia.
La senal luminosa, y por lo tanto la cantidad de conjugado anticuerpo-isoluminol, se mide con un
fotomultiplicador en unidades relativas de luz (RLU, relative light units) e indica la concentracion de PCT en
la muestra.
La muestra, el marcador ABEI, el
marcador FITC y las nano-
microesferas magneticas se
anaden en la reaccion y se
incuba durante 15min.
Entonces, se forma un complejo
inmune que es capturado por la
microesfera.
Despues del lavado y la separacion, se anade Starter 1 y Starter 2 en la cubeta. Se iniciara una reaccion de
quimioluminiscencia y se emitira luz.
El analizador mide la senal y muestra los resultados en RLU (Unidad de Luz Relativa). Utiliza una curva de
trabajo para calucular la concentracion de la muestra.
En el metodo de sandwich hay
una correlacion positiva entre
concentracion y RLU.
La Curva Master es creciente de
manera constante
2-MG
Se ha identificado como las cadenas ligeras de los antgenos del complejo de histocompatibilidad principal
HLA-A, -B y -C, de 100 aminocidos de longitud y asociados de forma no covalente a la cadena pesada. Se
produce en la superficie de las clulas nucleadas, abundantemente en linfocitos y monocitos y en muchas
lneas celulares tumorales.
La excrecion urinaria normal de 2-MG es inferior a 370 microgramos por 24 horas; las tasas ms altas se
interpretan como evidencia de disfuncin tubular. Se ha observado una mayor excrecin urinaria una alta
variedad de afecciones, enfermedades del tejido conectivo como artritis reumatoide, exposicin ocupacional
a metales pesados como cadmio y mercurio, infecciones del tracto urinario superior, trasplante de rinon y
nefrotoxicidad como resultado de la terapia con ciclosporina.
Las concentraciones sricas elevadas en presencia de una tasa de filtracin glomerular normal sugieren una
mayor produccion o liberacion de 2-MG. Se pueden observar niveles aumentados en enfermedades
linfoproliferativas tales como mieloma mltiple, leucemia linfoctica crnica, enfermedad de Hodgkin, linfoma
no Hodgkin; lupus eritematoso sistmico; Artritis reumatoide; ciertas infecciones virales, incluyendo
citomegalovirus, mononucleosis infecciosa.

Serum: 0.9-2.7 g/ml


random urine: <0.195 g/ml
Ensayo inmunoluminomtrico competitivo;
1. Use un anticuerpo monoclonal anti-2-MG, antigeno 2-MG purificado
y la muestra.
2. Se agregan las microperlas magnticas recubiertas con anti-FITC se
mezclan a fondo y se incuban a 37 C, formando complejos;
3. Despus se sedimentan en un campo magntico, decantar el
sobrenadante, luego lavarlo en ciclo por 1 vez.
4. Se aaden los reactivos iniciadores y se inicia una reaccin
quimioluminiscente rpida. La seal luminosa se mide mediante un
fotomultiplicador como RLU en 3 segundos y es proporcional a la
concentracion de 2-MG presente en las muestras.
Muestra, marcador ABEI,
marcador FITC y nano-
microesferas magneticas se
anaden en la reaccion y se
incuban durante 15min.
Los antigenos marcados con
ABEI y los antigenos de muestra
se unen competitivamente con
anticuerpos de marcado ABEI,
pero solo los antigenos de
marcado FITC capturan
microesferas.
Despues del lavado y la separacion,
anada Starter 1 y Starter 2 en la cubeta,
se iniciara la quimioluminiscencia y
emitira luz.
El analizador mide la senal y muestra los
resultados comunes, utiliza una curva
de trabajo para calucular la
concentracion de la muestra.
El antigeno marcado con FITC se une con el
anticuerpo sin marcador ABEI,
tambieen podria capturarse por microesfera,
pero no puede emitir luz. El antigeno de
muestra, que carece el conjugado FITC
, no puede unirse con la microesfera magnetica.
Ambos tipos de antigenos se unen
competitivamente con el anticuerpo de
marcador ABEI.
El antigeno marcado con FITC puede capturar
por microesferas magneticas.
Los antigenos y anticuerpos desvinculando
puede quitarse en el proceso de lavado.
En el metodo competitivo
hay una correlacion negativa
entre concentracion y RLU.
La Curva Master es
decreciente de manera
constante
VENTAJAS DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA

Alta sensibilidad (femtogramos 10-15 g).


No emplea radiactividad.
No genera riesgo contaminante ni ruido de fondo a la hora de efectuar el proceso del anlisis de una
muestra, control o estandar.
Los resultados son rpidos (generalmente a los 15 min).
Equipos automatizados de fcil manejo.
BIBLIOGRAFA

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Hallek M et al. Serum2-Microglobulin and Serum Thymidine Kinase are Independent Predictors of
Progression-Free, survival in Chronic Lymphocytic Leukemia and
GARCA RODRGUEZ, Carmia; MARTINEZ MALDONADO, Ivon,VENTAJAS DEL MTODO DE
QUIMIOLUMINISCENCIA FRENTE AL DE RADIOINMUNOANLISIS (RIA), Vis cienti. v.1 n.2 La Paz 2009
https://www.youtube.com/watch?v=NByLu5jV4HE&t=40s