KUIS

1.Bagaimanakah cara untuk mengetahui

kelainan pada molekul DNA?
2.Apakah yang disebut DNA probe dan apa
syaratnya?
3.Apakah guna reporter dan dimana
meletakkannya ?
4.Apakah gunaanya PCR, dan prosesnya ada
berapa tahap ?
 PERTEMUAN KE XIV

Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction
(RT PCR)
 RT - PCR
> Pengertian :
adalah proses pembentukan cDNA dengan
mRNA sebagai template.
> Komponen yang diperlukan :
1. sampel mRNA
2. Enzim reverse transcriptase
3.dNTP
4. reaksi buffer
5. oligo dT
6. ion Mg++
7. primer DNA
8. enzim DNA polimerase ( Taq polimerase )
Tahapan dalam pembuatan cDNA
1.Isolasi RNA total dari jaringa atau organ.
2. Elektrophoresis gel agarose untuk
memonitor keberhasilan isolasi RNA.
3.Sintesis cDNA dari mRNA melalui proses RT-
PCR.
4.Isolasi cDNA dari gel agarose.
5.Melabel cDNA
 1. ISOLASI RNA TOTAL DARI JARINGAN
ATAU ORGAN
Jaringan / sebagian organ
-digerus + buffer -detraksi/melisiskan sel
Yg mengandung
guanidium thiocynate -untk menghambat
aktivitas RNAase
Hasil penggerusan jaringan
dihomogenasi ditanpung dalam
eppendorf & di setrifuge
-Supernatan dibuang -endapan +lithiumclorid
(untuk memisah DNA dari
RNA)& disentrifuge.
-supernatan dibuang(mengandung DNA)
Endapan /pellet mengandung RNA,
+ buffer untuk pencucian sisa DNA dan pro
tein
RNA murni ( mengandung tRNA,rRNA, mRNA)
Syarat untuk isolasi RNA total:

1. Kondisi lingkungan harus bebas dari RNase.

2. Sampel yang akan diisolasi harus bebas dari
kontaminasi Rnase.
3. Alat-alat yang digunakan harus bebas
dariRNase( diautoklaf atau disemprot
ethanol 70%).
4. Laboran / peneliti harus menggunakan sarung
tangan untuk melindungi RNA hasil isolasi den
terha dap kontaminasi dengan Rnase.
 2. Elektrophoresis RNA murni hasil
isolasi
RNA murni hasil isolasi
+ gel loading buffer -untuk dimasukkan
dalam sumuran
+sinar UV elektr.

Pada Gel Elektr tampak

2 pita rRNA (28S dan 18S) dan
pita mRNA (ditas/dibawah/diantara pita rRNA)

Pita mRNA diangkat

(untuk dijadikan template pada pembentukan cDNA)
3.Sintesis cDNA dengan mRNA sebagai
template
Fragmen mRNA (hasil isolasi)
+ oligo dT -menempel pada ujung
3(templete pada poli A
tail).
+ dNTP - Untuk bahan cDNA
+ thermostabil - untuk sintesis cDNA dg
reverse transk template mRNA
( RTth)
mRNA berpasangan dengan cDNA

+ RNase.H - Untuk melisiskan mRNA

cDNA murni (untuk bahan PCR)

 Nucleic acid Sequencing
(Sekuensing asam inti)
Pengertian :
Adalah cara untuk mengetahui atau mengung
kapkan kode-kode genetik dari suatu molekul
DNA.
Macam metode sekuensing:
1 metode Allen Maxam & Walter Gilbert
(1977).

2. Metode Frederick Sanger (1975)

Metode Maxam - Gilbert
1. Fragmen DNA dimodivikasi dengan ujung yang berbeda:
a. Diberi ujung G, dengan bantuan enzim dimetil sulfat.
b. Diberi ujung A & G, dengan bantuan asam formiat.
c. Diberi ujung C & T, dihidrolisis dengan hidrosin.
d. Pada sub. C, diberi medium dengan kadar garam tinggi yang akan
menghalangi reaksi dengan T sehingga akan terbentuk fragmen
dengan ujung C saja.
2. FragmenDNA yang akan disequencing dilabel pada ujung 3
dengan zat radioaktif (P32).
3. Kemudian masing masing fragmen dengan ujung yang berbeda
dimasukkan dalam elektrophoresis:
a. Sumur I berisi fragmen DNA dengan ujung G
b. Sumur II berisi fragmen DNA dengan ujung A & G.
c. Sumur III berisi fragmen DNA dengan ujung C & T
d. Sumur IV berisi fragmen DNA dengan ujung T.
 Hasil elektrophoresis Maxam-Gilbert

G A&G C&T T
C
G G
A
T T
 Metode Sanger
Metode ini memanfaatkan kemampuan 2 sifat
dari DNA polimerase (Fragmen Klenow), yaitu:
1. Mampu mensintesis DNA dari dNTP
2. Ketidak mampuannya untuk membedakan
dNTP dengan ddNTP.

Catatan:
- dNTP kehilangan oksigen pada OH di C2 pentose
- ddNTP kehilangan 2 oksigen pada C2 dan C3
 Prosedure sequencing Sanger
1.Empat tabung masing-masing diisi dengan
dATP + ddATP (sedikit); (perband: 50 : 1)
dCTP + ddCTP
dGTP + dd GTP
dTTP + ddTTP,
Dengan demikian pada masing-masing tabung
yang berisi DNA dengan ujung sama , akan terjadi
reaksi yang akan menghasilkan fragmen-fragmen
DNA yang ukurannya tidak sama.
 Metode Sanger (lanjut)
Jika yang dirangkai oleh DNA polimerase
adalah dNTP, maka akan terbentuk rangkaian
DNA .
Jika yang dirangkai oleh DNA polimerase
adalah ddNTP maka akan menjadi terminal
dan proses polimerisasi nukleotida akan
berhenti disitu (pada ddNTP)
 Metode Sanger (lanjut)
Berdasarkan pemikiran tersebut diatas , maka metode sequencing menurut Sanger
dapat dilakukan pada 4 tabung reaksi yang terpisah, yang masing-masing
mengandung :
1. dATP + ddATP (sedikit)
2. dCTP + ddCTP (sedikit)
3. dGTP + ddGTP (sedikit)
4. dTTP + ddTTP (sedikit)

Dengan cara tersebut diatas maka pada tiap tabung akan dihasilkan sejumlah
fragmen DNA yang panjangnya tidak sama , tetapi pada ujung 3 dari tiap fragmen
DNA mengan dung basa N yang sama
Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan elektrophoresis dengan gel poliakrilamit,
sehingga terdapat pemisahan fragmen-fragmen DNA dari tiap tabung.
Contoh :
1.Pada tabung satu ada empat fragmen DNA dengan ujung A
2. pada tabung dua ada dua fragmen DNA dengan ujung C
3. Pada tabung tiga ada empat fragmen DNA dengan ujung G
4. Pada tabung empat ada2 fragmen DNA dengan ujung T.
Prosedure Sanger (Lanjut)
Penyusunan fragmen-fragmen DNA
Setelah diketahui hasil pemisahan berdasar
kan ukuran fragmen DNA pada gel poliakrilami
de, lalu dilakukan pengurutan fragmen mulai
dari yang paling pendek dan berakir pada
fragmen yang paling panjang.
Hasil penyusunan fragmen-fragmen itu meru
pakan hasil sequencing.
Adapun struktur DNA yang dicari adalah
komplemen dari hasil sequencing.
 KUIS
1. Apakah beda PCR dengan RT-PCR

2. Apakah tujuan dilakukan RT-PCR?

3. Bagaimanakah cara memperoleh template

asam inti utuk RT-PCR

4 Bagaimanakah cara menghilangkan template

pada RT-PCR
 Mutasi
Pengertian :
- Mutasi adalah perubahan materi genetik yang
memberi bentuk alternative pada tiap gene.
Beberapa keuntungan akibat mutasi bagi organisme:
1. dapat beradaptasi terhadap lingkungan
2. memungkinkan terjadinya diversitas genetik dalam
populasi.
3. mencegah terjadinya kepunahan bagi suatu jenis
organisme.
4. dapat memperbaiki sifat dari suatu jenis organisme.

Beberapa kerugian akibat mutasi:

1. dapat menimbulkan kelainan-kelainan akibat mutasi
2. menimbulkan sakit atau gangguan fisi maupun fisiologis.
 Macam mutasi

A. Mutasi gene :
>karena adanya perubahan struktur gene.

B. Mutasi chromosome:
>mutasi yang disebabkan oleh adanya
perubahan struktur, ukuran , atau jumlah
chromosome.
A. Mutasi gene
Sebab terjadinya mutasi
A. 1 Faktor fisis ( sinar, suhu, dsb)
2. Faktor kimia ( cholkisin, zat antibiotik, dsb).
B. Mekanisme mutasi dapat terjadi karena:
1. adanya kesalahan saat terjadi replikasi DNA
2. hilangnya basa-N pada gene (delisi)
3. tambahan /sisipan basa-N pada gene (insersi).
4. penggantian basa-N pada gene /DNA (substitusi)
5. adanya perubahan struktur basaN pada gene
(misalnya : tautomeri)
Macam mutasi gene
1. Point mutation;
karena perubahan salah satu basa-N pada gen
a. Missense mutation
b.Nonesense mutation.
c. Samesense mutation. (Silent mutation)

2. Frameshift mutation;
* Mutasi akibat insersi atau delisi suatu basa-N pada suatu gene
sehingga menyebabkan berubahnya seluruh kodon pada
rangkaian nukleotida berikutnya.

3. Tautomeri mutation;
*Tautomeri adalah berpindahnya atom hidrogen pada basa N
secara spontan sehingga menyebabkan terbentuk isomernya.
Point mutation
a. Missense mutation:
Mutasi akibat terjadinya penggantian (substitusi) satu
basa-N pada kodon, sehingga menyebabkan terjadinya
perubahan kodon dan perubahan polipeptida yang
dihasilkan.
Contoh :
Hb.A orang normal adalah :
1 2 3 4 5 6 7
Val His Leu Thr Pro Glu - Glu
(GAG)

Hb.S pada penderita Sickle Cell Anaemia

1 2 3 4 5 6 7
Val His - Leu - Thr Pro - Val - Glu
(GUG)
Sifat-sifat Sickle cell anaemia (Hb.S)
1. Eritrosit mudah pecah
2. eritrosit tidak mudah bergerak dalam
kapiler darah.
3. Afinitas Hb terhadap oksigen rendah,
sehingga penderita mengalami gejala
seperti penderita anaemia.
4. Eritrosit berbentuk cresent ( sickle = sabit)
5. Dapat menyebabkan kematian.
b. Nonsense mutation
Mutasi yang disebabkan adanya substitusi basa-N yang
menyebabkan terbentuknya kodon terminasi (UAG,
UGA atau UAA), sehingga pada saat proses translasi
akan dihasilkan protein yang pendek.
Akibatnya protein tidak berfungsi dan kehilangan sifat
biologisnya.
Contoh:
Varian globin, yang dikenal sebagai Mc.Kees Rock
kehilangan 2 asam amino terakhir sebelum kodon
terminasi ( kodon ke 145 dan 146) karena adanya
substitusi basa-N (U) pada kodon (UAU ) untuk tryonin,
diganti dengan basa-N (A) sehingga terbentuk kodon
UAA sebagai kodon terminasi.
c. Samesense mutation (Silent
mutation:
Mutasi yang menyebabkan yerjadinya
perubahan basa-N pada kodon, tetapi tidak
merubah janis asam amino yang dikode.
Contoh:
Perubahan kodon GGA akibat substitusi menja
di kodon GGC tidak akan merubah jenis asam
amino yang dikode,yaitu Glycine
2. Frameshift mutation
Mutasi yang disebabkan oleh adanya insersi(sisipan)
atau hilangnya(delisi) basa dari suatu kodon yang
mengakibatkan berubahnya seluruh kodon pada
rangkaian berikutnya.
Contoh:
Pada varian globin abnormal : (terjadi delisi) yang
dikenal sebagai Hb. Wayne I
No.kodon 138 139 140 141 142 147
Normal UCC AAA UAC CGU UAA -
Ser Lys Tyr Arg stop
Mutasi UCC AAU ACC GUU AAG UAA
Ser Asn Thr Val Lys stop
3. Mutasi akibat Tautomeri
Tautomeriadalah berpindahnya atom H pada
basa N secara spontan ,sehingga menyebab
kan terbentuknya isomer dari basa-N tersebut.
Adenine dan Cytosine dari struktur amino
dapat berubah menjadi struktur imino
(sebagai isomernya)
Guanine dan Thymine dari struktur keto
dapat berubah menjadi struktur enol (sebagai
isomerenya).
 Perubahan
1. bentuk amino ke bentuk imino
2. bentuk keto ke bentuk enol
 Mutasi (lanjut)
Struktur imino dari Adenosine dapat berikatan
dengan struktur amino dari Cytosine.
Struktur imino dari Cytosine dapat berikatan
dengan struktur amino dari Adenine.
Struktur enol dari Guanine dapat berikatan
dengan struktur keto dari Thymine.
Struktur enol dari Thymine dapat berikatan
dengan struktur keto dari Guanine.
Wolf Hischhorn Syndrom
(delisi chr. 4)
Perubahan str.chromosome
Mutasi chromosome (lanjut)
2. Mutasi karena perubahan struktur chromosome.
a. Inversi ( pembalikan gene ) pada chromosome.
b. Translokasi (berpindah lokasi): gene berpindah
lokasi pada chromosome yang sama maupun
chromosome yang berbeda.(yang homologe
maupun tak homologe).
C. Insersi (tambahan gene pada chromosome)
3. Mutasi karena perubahan jumlah chromosome.
Peristiwa ini dapat terjadi karena peristiwa non
disjunction.
Peristiwa ini dapat berupa monoploidi (N), Triploidi (2N +1)
atau poliploidi ( untuk 3 N ke atas)
a. Pada jumlah gonosome ( sex chromosome )
b. Pada jumlah autosome .
 Mutasi Perubahan jumlah gonosome
a. Mutasi karena perubahan jumlah gonosome
1. Turner syndrome,
Monosomi sex chromosome X pada wanita, sehingga jumlah
chromosomenya 44. X0 = (45).
Sifat penderita ini adalah :
* Ovarium rudimenter
* mandul
2. Kleinefelter Syndrome,
Trisomi pada gonosome laki-laki dengan jumlah chromosome
44 XXY = 47.
* Sifat penderita ini adalah :
* Testis tidak tumbuh.
* aspermia
* mandul
* tanda-tanda kelamin sekunder tidak tumbuh.
Turner syndrome
Kleinefelter syndrome
 Mutasi Perubahan Jumlah autosome
Tambahan jumlah autosome
1. Edward Syndrom :( 2N + 1) -> 47. XX atau
47. XY, trisomi , pada autosome no. 16, 17 , atau
no. 18.
2. Patau Syndrome : (2N +1) -> 47.XX atau 47.XY,
trisomi pada autosome no. 13, 14, atau
no.15. ( jarang terjadi
3. Down Syndrome : (2N + 1) -> 47.XX atau 47.XY
trisomi pada autosome No. 21
Perubahan jumlah chromosome (lanjut)
b. Perubahan jumlah autosome:
1. Edward Syndrome : ( 2N + 1),
Pada chromosome no. 16, 17 , atau 18.
Ciri-ciri:
* tengkorak lonjong,
* dada pendek dan lebar,
* telinga rendah
* ada lipatan epikantik
* mikrognathia
Edward syndrome
(Trisomi 18)
2. Patau Syndrome
Ciri-ciri:
* kepala kecil
* mata kecil
* telinga rendah dan buruk.
* Sumbing dan bercelah pada langit-langit
* polidaktili
* pertumbuhan tubuh lambat.
* kemunduran pada mental.
Patau Syndrome
(Trisomi 13)
3. Down Syndrome
Ciri ciri:
* mata sipit danbiasanya juling.
* tubuh pendek
* kaki pendek
* Kepala agak bundar
* bibir tebal dan agak menggelambir;
* mulut suka menganga
* leher pendek dan besar.
* telinga kecil
* telapak tangan gemuk dan pendek.
* jari kelingking bengkok ke dalam .
* gigi tak teratur
* kulit kasar dan kering
* otak kecil
+ pertumbuhan tubuh terganggu.
Down Syndrome
(trisomi 21)
 Fragile-X syndrome
Mutasi pada X chromosome dengan sisipan berulang(insersi)
trinukleotida (CGG) pada gene FMRI.
Ciri-ciri:
> Gangguan mental
> tangan suka menggepak-gepak
> bicara sering diulang-ulang
> hiperaktif
> perhatian tidak fokus
> emosi tidak terkendali
> muka lonjong
> kaki flat
> laki-laki seperti perempuan dengan muka lomjong.
Catatan :
Normal dengan : 6 54 CGG
Premutasi dengan : 54 200 CGG
Mutasi : > 200 CGG
Fragile X syndrome.
Fragile X syndrome