AMPLIFICACIN ISOTERMICA DE CIDOS

NUCLEICOS
PADILLA Yulieth; CRDENAS Roberth; QUEVEDO Hussey
Microbiologa, Biotecnologa II
2017
 AMPLIFICACIN ISOTERMICA DE CIDOS
NUCLEICOS
La amplificacin isotrmica de cidos nucleicos es un proceso simple que
acumula rpida y eficientemente secuencias de cido nucleico a
temperatura constante.

Diversas tcnicas de Reaccin en cadena de la

amplificacin isotrmica polimerasa (PCR)

Las tecnologas de amplificacin de cido nucleico se utilizan

en el campo de la biologa molecular y las tecnologas de ADN
recombinante. Estas tcnicas se utilizan como mtodos
principales para detectar y analizar una pequea cantidad de
cidos nucleicos.
La amplificacin isotrmica de cidos nucleicos ha surgido como una
alternativa prometedora. Adicionalmente, la amplificacin isotrmica
puede realizarse bajo condiciones simples:

Los cuales no son viables con

PCR.

Ms recientemente, las tcnicas de amplificacin isotrmica se han

expandido para detectar un amplio espectro de dianas, incluyendo
protenas, clulas, molculas pequeas e iones.
AMPLIFICACIN
NANOTECNOLOGA
ISOTERMICA

Nanoestructuras de prometedores en
PROPORCIONA ACIDOS Hidrogeles de cidos
metales nucleados con biosensores, bioimgenes
NUCLEICOS nucleicos
cido nucleico nanomedicina
 Amplificacin
Isotrmica
Temperatura constante.
Rpida, y no requiere termociclador.
Diferentes agentes de desnaturalizaci-
n.
Tolerancia a compuestos biolgicos-
Variable.
Tiempo de deteccin menor.
PCR- Reaccin en
Cadena de la Polimerasa
Cctel de reaccin entre diferen-
tes temperaturas.
Requiere de termociclador.
Calor.
Cero tolerancia a compuestos
biolgicos.
Mayor tiempo de deteccin.
Usa dos primers- 5-3.
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA
AMPLIFICACIN ISOTRMICA VS PCR
Recientemente, Kaneko et al.
Una de las ventajas ms importantes de las tcnicas de
evaluaron la tolerancia de LAMP a
amplificacin isotrmica est relacionada con sus tolerancias
un medio de cultivo y algunas
con algunos materiales inhibidores que afectan la eficiencia de
sustancias biolgicas.
la PCR.

la sensibilidad de LAMP fue menos

el ADN genmico del patgeno puede afectada por los diversos
incluso detectarse en una muestra de componentes de las muestras
sangre humana. Esto demuestra que clnicas que la PCR; por lo tanto, se
HDA se puede realizar en muestras de puede omitir la purificacin del ADN.
crudo y tiene el potencial de ser
utilizado como una herramienta de
diagnstico.
 Otra ventaja importante de las tcnicas de amplificacin
isotrmica es que no hay necesidad de desnaturalizacin
trmica inicial a alta temperatura seguida por amplificacin a
una temperatura ms baja.

la PCR sufre de inconvenientes que llev al desarrollo de

mtodos de amplificacin alternativos. Entre ellos, el tiempo
de ciclo trmico entre las diferentes temperaturas necesarias
para obtener la secuencia objetivo de amplificacin. Cuando se
comparan con los mtodos de PCR, los mtodos de
amplificacin isotrmica:

requieren menos energa que los mtodos de PCR que

no requieren ningn ciclo trmico. son ms fciles de operar. requieren etapas de calentamiento y enfriamiento
rpidas.
 PROPIEDADES DE VARIOS MTODOS DE
AMPLIFICACIN ISOTRMICA

Motamedi, M., Saghafinia, M., Karami, A., & Gill, P. (2011). A review of the current isothermal amplification techniques:
Applications, advantages and disadvantages. Journal Of Global Infectious Diseases, 3(3), 293. http://dx.doi.org/10.4103/0974-
777x.83538
 PRINCIPALES TCNICAS DE
AMPLIFICACIN ISOTERMICA
+10 tipos-Isothermal Amplification of Nucleic Acids
La amplificacin mediada por transcripcin La replicacin de secuencia autosostenida
(TMA). (3SR).

la amplificacin basada en secuencias de La amplificacin mediada por seal de la

cidos nucleicos (NASBA). tecnologa de ARN (SMART).

La amplificacin isotrmica de desplazamiento La amplificacin dependiente de helicasa

mltiple (IMDA). (HDA).

La amplificacin isotrmica de un solo cebador La amplificacin isotrmica de desplazamiento

(SPIA). circular amplificacin (cHDA).
1 AMPLIFICACIN MEDICADA POR TRANSCRIPCIN (TMA) / AMPLIFICACIN
BASADA EN LA SECUENCIA DEL CIDO NUCLEICO (NASBA):

(TMA) Muy similar (NASBA)

Utilizan la funcin de una ARN polimerasa para producir ARN a partir de

un promotor manipulado en la regin de cebador, y una transcriptasa
inversa, para producir ADN a partir de las plantillas de ARN.

Se ha introduciendo una tercera actividad enzimtica, la Rnasa H, para

eliminar el ARN del cDNA sin la etapa desnaturalizada por calor.

Eliminando la etapa de termociclado, generando un mtodo de

amplificacin isotrmico denominado replicacin de secuencia auto-
sostenida (3SR).
Vicky Trger , Katja Niemann , Cornelia Grtig y Dirk Kuhlmeier, 10 de abril de
2015
 APLICACIONES

El desarrollo de NASBA, ya se aplic para la deteccin y cuantificacin

rpidas de VIH-1 en muestras de sangre de pacientes. Debido al uso
directo del ARN tambin, este mtodo de amplificacin isotrmica es
ptimo para la deteccin de virus ARN, pruebas de viabilidad de clulas y
caracterizacin transcripcional.
Zhao et al. han informado sobre una plataforma microfluida de
amplificacin cuantitativa compuesta por un mdulo de muestreo basado
en la membrana, un casete de preparacin de muestra y un chip Q-NASBA
de 24 canales para investigaciones ambientales sobre microorganismos
acuticos.
 AMPLIFICACIN MEDIANTE LA SEAL DE LA TECNOLOGA DE ARN
2 (SMART)

Esta tecnologa se basa en la formacin de una estructura de tres vas (3WJ).

El mtodo se basa en la amplificacin de seal y no requiere ciclos trmicos
o implica la copia de secuencias diana. El ensayo genera una seal que es
altamente dependiente del objetivo y es apropiada para la deteccin de
dianas de ADN o ARN.
Dos sondas oligonucleotdicas de cadena
sencilla en correspondencia con extensin y
plantilla. Las dos sondas se
recoplan entre s en
SMART presencia del objetivo
especfico, formando as
Cada sonda incluye una regin que puede
hibridarse con el blanco en posiciones un 3WJ
adyacentes y otra regin mucho ms corta
que hibrida con la otra sonda.
 SMART
1. Las sondas de extensin y plantilla
recobran el ADN de la plantilla
formando un 3WJ; 2. La ADN
polimerasa alarga la sonda de
extensin, formando as una regin
promotora de ARN ds T7; 3. La ARN
polimerasa se une al promotor ds T7
y produce numerosas
transcripciones de ARN que sirven
como seal; 4. Posible deteccin:
una sonda de captura de unin a
ARN, unida a una estreptavidina
inmovilizada; La sonda de deteccin
ligada a la fosfatasa alcalina permite
la conversin del sustrato. Vicky Trger , Katja Niemann , Cornelia Grtig y Dirk Kuhlmeier, 10 de abril de
2015
 APLICACIONES DE SMART

Se ha demostrado una deteccin rpida de 100 fmol / L a partir de una

secuencia artificial de vRNA de la gripe A H5 que requiere solo 5 L de
volumen de reaccin. Morabito et al. han presentado la deteccin de una
mutacin de resistencia a frmaco de transcriptasa inversa de VIH-1, que
se realiz en parte en una plataforma de microfluidos en menos de 180
min.
Para la cuantificacin de la reaccin, el enfoque de bala molecular se ha
aplicado con xito.
3 AMPLIFICACIN ISOTERMICA MEDIANTE LOOP (LAMP)

La amplificacin isotrmica mediada por bucle (LAMP) es una tecnologa de

amplificacin de cido nucleico que amplifica el ADN bajo condiciones
isotrmicas.
Cuatro a seis cebadores, ADN polimerasa con actividad
especficos diseados de desplazamiento

El mtodo LAMP es tambin un

Los productos de amplificacin son
estructuras de ADN de tallo-lazo con
varias repeticiones invertidas de la
diana y estructuras de tipo coliflor con
bucles mltiples.
mtodo de amplificacin altamente
eficiente que la amplificacin
isotrmica mediada por Loop (LAMP)
es una tecnologa de amplificacin
de cido nucleico que amplifica el
ADN en condiciones isotrmicas.
Vicky Trger , Katja Niemann , Cornelia Grtig y Dirk Kuhlmeier, 10 de abril de 2015
 APLICACIONES

Hsieh et al. present un dispositivo microfludico LAMP con

un sensor electroqumico integrado. Se aadi azul de metileno, un
compuesto de unin a ADN electroqumicamente activo, a la mezcla de
reaccin. Se midi una gota de corriente debido a la intercalacin de azul
de metileno en el ADN recin formado, dando un LOD de 16 copias para C.
enterica.

Chuang et al. demostr un cartucho de deteccin de resonancia de

plasmn de superficie sencillo y de bajo costo, basado en el mtodo LAMP
para la deteccin en un sitio del virus de la hepatitis B.
4 AMPLIFICACIN DEL CRCULO RODANTE (RCA)

La amplificacin del crculo rodante (RCA) genera mltiples copias de una

secuencia para el uso de la amplificacin de ADN in vitro adaptada de la
replicacin del ADN del crculo rodante in vivo.

Esta reaccin se usa ampliamente con

En su formulacin original, la reaccin
de RCA implica numerosas rondas de
sntesis enzimtica isotrmica en las
que la ADN polimerasa extiende un
cebador hibridado en crculo
progresando continuamente alrededor
de la sonda de ADN circular de varias
docenas de nucletidos para replicar su
secuencia una y otra vez.
fines de diagnstico en la deteccin
directa o indirecta de diferentes ADN /
ARN, protena, y otros biomarcadores a
travs de un conjunto de diversos
eventos de reconocimiento bimolecular.
Tambin se describi una reaccin
similar para las ARN polimerasas, pero el
proceso generado por ARN no requiere
ningn cebado dependiente de la
hibridacin.
AMPLIFICACIN DEL CRCULO RODANTE (RCA)

Vicky Trger , Katja Niemann , Cornelia Grtig y Dirk Kuhlmeier, 10 de abril de 2015
 APLICACIONES
Los enfoques basados en RCA han atrado recientemente atencin de
empresas de biotecnologa orientadas al diagnstico e investigacin
centros para pruebas genticas e inmunoensayos, secuenciacin y
preparacin de plantillas, sistemas de anlisis de clulas individuales y
expresin de genes.
La RCA optimizada fue capaz de detectar 0,163 pg (~ 60 molculas) de
ADN genmico de Listeria monocytogenes o 143 zmol (8,6 x
10 4 molculas) de ARNm de CD4 humano transcrito in vitro.
Sato et al. describi un RCA en fase slida para la deteccin en
el chip de secuencias de Salmonella enterica. La Figura
9 muestra la captura y ligacin de un ADN diana especfico a 55
C. Se prehibrida una imprimacin circular con el cordn de
captura de 34 m. Despus de una etapa de ligacin, la cadena
lineal es producida por RCA. Para finalmente cuantificar el
producto, se hibrid una sonda fluorescente con el amplicn.
5 AMPLIFICACIN DEPENDIENTE DE LA HELICASA (HDA)

La amplificacin dependiente de Helicasa (HDA) se basa en la actividad de

desenrollamiento de una helicasa de ADN. Este proceso utiliza una
helicasa, en lugar de calor, para separar las dos cadenas de un dplex de
ADN generando plantillas monocatenarios con el fin de la amplificacin in
vitro de un cido nucleico diana.

Los cebadores especficos de la secuencia se hibridan con las plantillas y

luego se extienden mediante polimerasas de ADN para amplificar la
secuencia diana.

Este sistema termfilo HDA se desarroll adicionalmente para aplicaciones de diagnstico

por Goldmeyer et al; informaron que el HDA es adecuado para la rpida caracterizacin
de Staphylococcus aureusy la determinacin de la resistencia a la meticilina mediante la
deteccin del gen mec A.
 Una helicasa
desenrolla la cadena
de ADN diana a una La protena MutL estimula el
temperatura de 37 desenrollamiento de la
C para eludir la etapa helicasa.
de desnaturalizacin
inducida por calor de
la PCR. El desarrollo de una helicasa
termoestable de
Thermoanaerobacter
tengcongensis permiti
conducir la reaccin a una
temperatura de 45 C a 65 C

Andresen D, von Nickisch-Rosenegk M, Bier FF (2009) Helicase depende de la amplificacin

OnChip y su uso en la deteccin de patgenos mltiples. ClinChimActa 403: 244-248.
 APLICACIONES
La HDA ha demostrado ser efectiva para varias muestras, desde orina e
hisopados vaginales hasta sangre y heces . Por lo tanto, la HDA tiene un
gran potencial para usarla en dispositivos porttiles de cuidados.

La deteccin de Staphylococcus aureus a partir de torundas nasales se

present en un estudio de Frech et al., Cuando se utiliz una HDA
asimtrica para amplificar secuencias especficas, que se hibridaron para
capturar sondas en una matriz de ADN. La lectura fue visible a simple vista
mediante un proceso enzimtico que emplea el colorante
Tetramethylbenzidine.
 RESUMEN DE LOS MTODOS IMPORTANTES DE
AMPLIFICACIN ISOTRMICA

Yongxi Zhao*, Feng Chen, Qian Li, Lihua Wang, and Chunhai Fan*; (2015), Isothermal
Amplification of Nucleic Acids, American Chemical Society 2015, 115 (22), pp 1249112545
 PRINCIPALES APLICACIONES DE LA AMPLIFICACIN ISOTRMICA
DE CIDO NUCLEICO

Yongxi Zhao*, Feng Chen, Qian Li, Lihua Wang, and Chunhai Fan*; (2015), Isothermal
Amplification of Nucleic Acids, American Chemical Society 2015, 115 (22), pp 1249112545
ARTICULO DE ESTUDIO
1 Divisin de Enfermedades Transmitidas
Emergentes y Transfusionadas, Centro de
Evaluacin e Investigacin de Biolgicos,
Administracin de Alimentos y Medicamentos,
Silver Spring, MD, EUA
2 Departamento de Biologa, Morgan State
University, Baltimore Maryland, EE. UU.
un correo electrnico: moc.rotcod@naynd
b Correo electrnico:
ude.nagrom@nosniws.nivek
 QU SE HIZO EN EL ESTUDIO?

Se ha desarrollado un ensayo de amplificacin isotrmica mltiplex rpida para la

deteccin e identificacin de mltiples virus de transmisin sangunea que infectan a
millones de personas en todo el mundo.

Fueron diseados conjuntos de oligonucletidos y oligofluoroforos especficos de virus y

utilizados en una reaccin de amplificacin isotrmica multiplex mediada por bucle de
transcripcin inversa para la deteccin e identificacin electrofortica en gel de virus:
Inmunodeficiencia humana (VIH).
Virus de hepatitis B (VHB).
Virus de hepatitis C (VHC).
Virus de la hepatitis E (VHE).
Virus dengue (DENV) e infeccin del virus del Nilo Occidental (VNO) en el plasma
sanguneo.

Sensibilidad 97%; Especificidad 100%

 Este trabajo describe el desarrollo del primer ensayo de
amplificacin isotrmica mediado por bucle fluorognico
mltiple para la deteccin e identificacin simultneas de 6
patgenos virales diferentes en plasma humano

Este ensayo se basa en la hibridacin fluorgena y la sntesis de ADN de desplazamiento

de cadena de autociclado que est mediada por bucle en condiciones de amplificacin
isotrmica y produce repeticiones de amplicones de cido nucleico como patrones de
bandas similares a una escalera.

Utiliza 3 pares de cebadores especficos de virus (que

Que se dirigen a 8 secuencias diferentes dentro de
incluyen oligonucletidos fluorognicos especficos de
la regin genmica de inters
diana).

Los oligonucletidos fluorognicos especficos se hibridan solo con la secuencia diana del
ADN amplificado, dando como resultado la emisin de fluorescencia que es visible a simple
vista bajo iluminacin UV y medible con un espectroscopio de fluorescencia.
El proceso de amplificacin se lleva a cabo dentro de 30-60 minutos, utilizando una fuente de
calefaccin digital porttil.

(A) Ilustracin de las posiciones de los oligonucletidos y oligofluorforos utilizados para la deteccin de
secuencia especfica en el 5'-NCR del genoma del VHC. (B)El mecanismo biomolecular del
oligonucletido inverso de bucle bi-etiquetado (LRp) se uni covalentemente con 6-FAM como
informador en el extremo 5 'y BHQ1 como desactivador en el extremo 3'.
Deteccin de mltiplex e identificacin de virus.Los cidos nucleicos vricos de referencia
estndar se sometieron a amplificacin isotrmica mltiple para evaluar la capacidad de
deteccin del ensayo utilizando cebadores especficos de virus y oligonucletidos
fluorognicos especficos. Los objetivos detectados se identificaron mediante anlisis de
patrones de bandas.
 Especificidad analtica

Los resultados de electroforesis en los 4 paneles muestran la deteccin de

los objetivos como lo demuestran los patrones de bandas similares a las
de las escaleras, especficos del virus.
 Anlisis fluorimtrico de productos de reaccin

Co-deteccin de virus con oligofluoroforos especficos. Dos oligonucletidos

fluorognicos (6-FAM / BHQ1-HIVLRp y 6-FAM / BHQ1-HCV-LRp) se aplicaron
simultneamente en reaccin mltiple que contena todos los cebadores en la Tabla 1para
la deteccin del virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (
VIH) extractos de cidos nucleicos.
Los resultados de la amplificacin mostraron que el ensayo detect 36 de 37 muestras clnicas
infectadas, lo que demuestra una sensibilidad diagnstica del 97%. Los resultados revelaron
adems que las 52 muestras de plasma controladas por el ensayo reaccionaron
negativamente, lo que demuestra una especificidad diagnstica del 100%.
 Formando lderes para la
construccin de un nuevo pas en
paz