Anda di halaman 1dari 17

KROMATOGRAFI AFINITAS

YURIKA WITAZORA
1727011004
PENGERTIAN

Kromatografi afinitas adalah suatu teknik pemurnian


yang dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein
terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim
terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas
antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon
terhadap reseptornya.
Afinitas adalah sejauh mana suatu substansi cenderung
ingin mengikat dengan yang lain.
kromatografi afinitas merupakan varian dari kromatografi
yang menggunakan spesifitas biologis pada interaksi
antara analit dan ligan pemisahan.
PENGERTIAN
Teknik pemurnian berdasarkan afinitas enzim atau protein
KROMATOGRAFI AFINITAS
terhadap biomolekul lain (ligan)

Menggunakan spesifitas biologis pada interaksi antara analit


IUPAC dan ligan pemisahan

Sejauh mana suatu substansi cenderung ingin mengikat


AFINITAS
dengan yang lain
PRINSIP DASAR
Interaksi spesifik antara satu jenis molekul zat terlarut
dengan jenis molekul lain yang terimmobilisasi dalam fase
diam

SPESIFITAS BIOLOGIS -Konformasi yang dapat mengenali komponen lain


-Berikatan karena memiliki bentuk yang sesuai

Enzim ---- Substrat

Antigen ---- Antibodi

Hormon ---- Reseptor


KOLOM PADA KROMATOGRAFI AFINITAS

FASE DIAM FASE GERAK


membuat salah satu komponen Pelarut = buffer aplikasi
terimobilisasi pada matriks atau dapat (application buffer)
disebut material pendukung (support
material). Molekul yang memiliki afinitas yang
Media padat tersebut kemudian dimasukan spesifik dengan ligan akan
dalam kolom kromatografi yang kemudian berinterakasi (binding) dengan ligan
dikenal sebagai ligan afinitas (affinity ligand).
Ligan tersebut merupakan fasa stasioner atau sehingga molekul lain akan keluar
fasa diam pada kolom kromatografi afinitas. terlebih dahulu dari kolom. Setelah
Komponen yang diinginkan tidak harus itu, untuk memisahkan ligan
menjadi komponen yang dapat berikatan dengan molekul yang terikat kuat
dengan ligan. Komponen pengotor juga dengannya, molekul tersebut
dapat berikatan dengan ligan sehingga
komponen yang diinginkan dapat keluar dari dielusi menggunaan pelarut yang
kolom dengan bebas dan cepat. disebut elution buffer.
Prinsip Kerja
Pemilihan Matriks
Syarat matriks:
1. Inert
2. Hidrofilik
3. Stabil secara kimia
4. Stabil secara mekanik
5. Ukuran pori sesuai ligan
6. Diameter partikel matriks sesuai ligan
Pemilihan Ligan

peptida, protein, oligosakarida


BIOLOGIS dan (oligo)-nukleotida.
SUMBER
SINTETIK
Pemilihan Ligan
-Deoksiribonukleotida (DNA)
STRUKTUR NUKLEOTIDA - Oligonukleotida dan koenzim
nukleotida

- Peptida linier
JENIS MOLEKUL STRUKTUR PEPTIDA - Mikroprotein

PEWARNA TEKSTIL

-NAD, Lektin ,Lisin, Gelatin, Green A,


GROUP SPESIFIK GELS Blue B, dll.
INTERAKSI DENGAN
KOMPONEN TARGET
COVALENT COUPLING GELS -NH2, SH, OH, COOH
Penyematan Ligan Pada Matriks
PERMUKAAN ATAU
RESIN (MATRIKS)
PEMBENTUKAN FASE
PENGIKAT (SPACER)
STASIONER

LIGAN Multi-site attachment, steric


(Gugus Fungsi NH2, COOH, SH) hindrance, orientasi dari ligan

IMOBILISASI DENGAN
IKATAN KOVALEN

-- Interaksi spesifik (konformasi spesifik)


TEKNIK PENYEMATAN ADSORPSI PERMUKAAN
-- Interaksi nonspesifik (ik. H, hidrofobik)
LIGAN PADA MATRIKS
DIPERANGKAP DALAM PORI
- Capping agent (tidak ada ikatan)
(ENTRAPMENT)

KOORDINASI DENGAN ION


LOGAM
TAHAPAN PEMURNIAN

TAHAP 3
BUFFER
ELUSI

ELUSI
-MENAMBAHKAN REAGEN BARU
TAHAP 2 DAN -MENURUNKAN NILAI Ka
PENCUCIAN (konstanta kesetimbangan
disosiasi),
-MENINGKATKAN KONSENTRASI
PENGIKATAN GARAM
-MENGUBAH pH

- PENGIKATAN KOMPONEN TARGET


TAHAP 1 SAMPEL OLEH LIGAN
DAN - PENCUCIAN KOMPONEN BUKAN
MATRIKS TARGET DENGAN WASH BUFFER

PENANGANAN

-SAMPEL HARUS ENCER


PERSIAPAN SAMPEL DAN APLIKASI

Sampel harus jelas dan bebas dari partikulat.


Jika memungkinkan, uji afinitas ligan: interaksi molekul target.
Terlalu rendah affnity akan menghasilkan hasil yang buruk karena protein target dapat
tercuci atau bocor dari kolom selama aplikasi sampel.
Terlalu tinggi affnity akan menghasilkan hasil yang rendah karena molekul target mungkin tidak
terdisosiasi dari ligan selama elusi.
Untuk interaksi dengan persaudaraan yang kuat antara ligan dan molekul target yang dengan cepat
mencapai ekuilibrium, sampel dapat diterapkan pada tingkat penurunan yang tinggi.
Saat bekerja dengan interaksi persalinan yang sangat lemah yang lambat mencapai keseimbangan,
mungkin berguna untuk menghentikan penangkaran setelah menerapkan sampel agar
memungkinkan lebih banyak waktu agar interaksi berlangsung sebelum terus mencuci kolom.
Jangan mulai elusi zat target sampai semua bahan tak terikat telah dicuci melalui kolom oleh
penyangga yang mengikat (ditentukan oleh absorbansi UV pada 280 nm). Hal ini akan
meningkatkan kemurnian zat target yang dielusi.
ELUSI
ANALISIS HASIL DAN LANGKAH SELANJUTNYA

Analisis hasil dari pemisahan pertama dapat


menunjukkan apakah purifcation perlu ditingkatkan
untuk meningkatkan hasil, mencapai kemurnian yang
lebih tinggi, mempercepat pemisahan atau
meningkatkan jumlah sampel yang dapat diproses
dalam jangka tunggal.
APLIKASI

Pendekatan Baru Pemurnian Pra-mir-29 Menggunakan


Kromatografi Afinitas-Lisin
Terapi gen berbasis miRNA memerlukan microRNA dengan derajat kemurnian tinggi,
kualitas bagus dan aktif secara biologis
Pengembangan prosedur inovatif yang mudah dan efisien dalam memurnikan RNA
Kromatografi afinitas dengan ligan lisin untuk memisahkan pre-miR-29 dari campuran RNA
kecil secara efisien
memurnikan pra-miR-29 dari campuran kompleks yang mengandung RNA kecil (sRNA)
Rhodovulum sulfidophilum
FASE DIAM = matriks Lysin-Agarose
FASE GERAK = 0,05% dietil pyrocarbonate (DEPC) air olahan (buffer apliaksi)
BUFFER ELUSI BERGARDIEN = 2.0 M dari (NH4) 2SO4 dalam 10 mMTris (pH 8.0),
meningkat menjadi 1,5 dan 1,1 M (NH4) 2SO4 dan kemudian menjadi 10 mM Trisbuffer (pH
8.0).
HASIL PENELITIAN
KESIMPULAN

1. kromatografi afinitas, yaitu kromatografi cair yang menggunakan bantuan agen


pengikat spesifik (interaksi Ligan dan molekul target)
2. Interaksi terjadi karena adanya spesifitas biologis seperti bentuk atau konformasi
yang dapat mengenali komponen lain lalu berikatan karena memiliki bentuk
yang sesuai
3. Interaksi ini bersifat sangat spesifik sehingga sangat bisa diandalkan untuk
memurnikan produk dengan kualitas tinggi
4. Pemilihan ligan bergantung pada afinitas terhadap molekul target yang akan
diikat (ex : afinitas enzim dengan inhibitornya; substrat dengan produknya;
antibodi dengan antigennya; hormon terhadap reseptornya)
5. Kromatografi afinitas-lisin dapat digunakan untuk memurnikan pra-miR-29 dari
campuran kompleks yang mengandung RNA kecil (sRNA) Rhodovulum
sulfidophilum
6. Hasil eluen yang ditampung memberikan peak tinggi (peak 1) dan ditegaskan
dengan elektroforesis pada jalur 1 sebagai pra-mIR-29 murni.

Anda mungkin juga menyukai