BIOTEGNOLOGI

PERTANIAN
Sejarah perkembangannya:
3000 s.M minuman beralkohol (melalui fermentasi); namun dasar-dasar ilmiahnya baru
pada abad ke-17.
1680 Leeuwenhoek amati bentuk sel-sel khamir.
1818 Eryleben; mulai ketahui fermentasi oleh sel-sel khamir.
1857 Pasteur; penemuan fermentasi asam laktat.
1897 Buchner jelaskan enzim yg berperan dlm fermentasi; memahami proses fermentasi;
diikuti penemuan2 lain dlm bidang mikrobiologi mikrobiologi merupakan salah satu
dasar utama perkembangan bioteknologi.
1928 Griffith; menemukan mutan bakteri Pneumococcus tipe R (non-patogenik) dpt alami
transformasi tipe S (patogenik).Pnemococcus tipe R hidup campur dg tipe S yg
mati injeksikan pd tikus tikus mati. Isolasi darah tikus tsb.; terdpt strain tipe S yg
hidup. Perubahan tipe R (hidup) tipe S (hidup) bersifat permanen. Proses transfor-
masi itu dpt dilakukan secara in vitro the transforming principle
1944 Avery, McLeod + McCarty: the transforming principle merupakan senyawa as. nukleat
tipe deoksiribose sifat genetik ditentukan DNA.
1953 Avery & Crick : struktur 3 dimensi DNA.
Nathan & Smith menemukan enzim yg dpt potong DNA secara spesifik (endonuklease
restriksi); hasilkan DNA spesifik. Enzim DNA ligase mampu sambung potongan DNA.
1970-an Berg gunakan enzim DNA restriksi & DNA ligase berhasil sambung molekul DNA
suatu virus mol. DNA rekombinan. mendpt hadiah Nobel !
Pengembangan teknologi baru yg disebut teknologi DNA rekombinan rekayasa
genetik. Para ahli mampu melakukan perubahan2 sifat genetik organisme secara ter-
arah (yg diinginkan) misalnya tanaman / organisme transgenik (GMP / GMO):
Genetically Modified Plants / Genetically Modified Organisms.
 MIKROBIOLOGI BIOLOGI MOLEKULER

BIOKIMIA / KIMIA GENETIKA

REKAYASA KIMIA ELEKTRONIK

ILMU PANGAN REKAYASA MEKANIK

TEKNOLOGI PANGAN BIOTEKNOLOGI KOMPUTER

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN BIOTEKNOLOGI INDUSTRI

BIOTEKNOLOGI LINGKUNGAN BIOTEKNOLOGI KESEHATAN

Ilmu dasar dan teknologi yg mendasari perkembangan bioteknologi modern
serta 4 cabang utama bioteknologi.
Aplikasi bioteknologi dlm bidang:

Pertanian Kesehatan Industri Lingkungan

Pengembangan tanam- Produksi bahan tera- Produksi bahan industri Penanganan limbah
an transgenik peutik

Kandungan provitamin Produksi insulin Produksi beragam Ekstraksi & akumulasi

A tinggi gunakan mikroba enzim rekombinan logam berat

Toleran thd lingkungan Prod. vaksin hepatitis Produksi metabolit pri- Degradasi pestisida &
salinitas tinggi B rekombinan mer (mis. As. Amino) senyawa sejenis
 PENDAHULUAN
Bioteknologi
Penerapan prinsip-prinsip biologi, biokimia, dan rekayasa dlm pengolahan bahan
dengan memanfaatkan jasad hidup atau / dan komponen2-nya untuk hasilkan
suatu produk yg diinginkan berkaitan dengan reaksi-reaksi biologis.
Bioteknologi modern ; teknik manipulasi DNA secara in vitro; manipulasi genetik.
Komponen organisme: sel, jaringan, organel, molekul-molekul tertentu (DNA, RNA,
protein, enzim).
Bioteknologi konvensional Bioteknologi modern

1. Relatif murah; teknologi relatif sedehana 1. Relatif mahal; teknologi canggih

2. Efek jangka panjang umumnya sdh diket. 2. Pengaruh jangka panjang belum dike-
karena sistemnya sudah mapan tahui
3. Perubahan sifat genetik tidak terarah 3. Perbaikan sifat genetik terarah
4. Tidak dpt atasi inkompatibilitas genetik 4. Dapat atasi inkompatibilitas

5. Hasil tdk dpt diperkirakan sebelumnya 5. Hasil dapat diperkirakan

6. Butuh relatif lama hasilkan galur baru 6. Dpt hasilkan 7 perpendek waktu

7. Butuh relatif lama hasilkan galur baru 7. Perpendek waktu hasilkan galur baru
dgn sifat baru yg tdk ada secara alami

8. Sering tdk dpt atasi kendala alam dalam 8. Dpt tingkatkan kualitas & atasi kendala
sistem budidaya tanaman alam dlm sistem budidaya tanaman
Schematic representation of shoot tip culture
Schematic representation of vegetative propagation by single node technique.
Setiap bahan tanaman memp. tingkat kontaminasi permukaan yb berbeda,
tergantung dari:
- jenis tanaman & bagian tanaman yg digunakan
- morfologi permukaan (mis. berbulu / tidak)
- lingkungan tumbuh ( rumah kaca / lapangan)
- musim waktu mengambil (musim hujan / kemarau)
- umur tanaman (kecambah / tanaman dewasa)
- kondisi tanaman (sakit / sehat)
Sterilisasai eksplan, umum digunakan NaClO 1%, H2O2 10%, alkohol 70 %, larutan
bromin 1%, HgCl2 0,01-1% (sangat toksik !), fungisida (benlate), antibiotik 4-50 ppm
(rifamisin, streptomisin, carbenisilin).
Komposisi media kultur : 1) unsur hara makro dan mikro
2) sumber energi : sukrosa, glukosa
3) vitamin : thiamin (B1), piridoksin (B6)
4) ZPT / Growth regulators : auksin (sesuai tipe pertum-
buhan yg dikehendaki, level auksin endogen), sitokinin
(kinetin, zeatin, BAP), dan giberelin (utk membantu mor-
fogenesis)
Disamping golongan senyawa organik yg kandungannya jelas, dlm media kultur
sering pula ditambahkan senyawa kompleks alamiah yg komposisinya dpt berbeda
dari sumber yg satu dg lainnya,spt air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak pisang, ekstrak
kentang, jus tomat, dll.
Tahapan kerja sterilisasi eksplan di dalam LFC
Schematic representation of axillary bud method of vegetatively propagating plants.
a) Rosette plants; b) elongate plants
Diagrammatic summary of steps involved in Berman cell planting technique.
Diagrammatic illustration of anther and microspores culture for production of haploid plants and diploidization
 BIOTEKNOLOGI MIKROBA
Mikroba : - eukariot Saccharomyces cerevisiae
- prokariota - Eubacteria
- Archaea
Berbagai produk gunakan mikroba: utk dikonsumsi, pupuk / pestida hayati, farmasi, dll.
Prinsip dasar kultivasi, digunakan:
- medium padat / solid medium tempe, oncom
- medium cair / liquid medium antibiotik, asam-asam amino
Berdasarkan komposisi medium:
- medium lengkap: bahan organik, ekstrak bahan alamiah (khamir, daging) + bahan
anorganik mikroba tumbuh optimal
- medium minimal defined medium: bahan kimia sintetis pertumbuhan minimal; lebih
ke arah analisis fisiologis / genetika yg butuh komposisi nutrisi spesifik (utk hasilkan
produk tertentu).
Dalam industri bioteknologi, medium lengkap sering + komponen tambahan berpengaruh
signifikan thd jumlah produk + biotin utk memacu produksi antibiotik atau as.amino.
Teknik kultivasi mikroba:
1) Kultur batch (sekali panen) mikroba ditumbuhkan dlm medium pertumb. maksimal
panen produknya (sel/biomassa atau produk metabolitnya) kultivasi awal lagi.
Pola pertumb. mikroba dlm kultur batch:
- fase lag /adaptasi, tergtg: status fisiologis, macam mikroba, kondisi medium seblmnya
- fase eksponensial / logaritmik; pertumb. dipercepat / accelerated growth phase
- fase pertumb. diperlambat / deccelerating growth phase
- fase stasioner, ratio yg tumbuh dan mati seimbang jumlah sel secara total tetap
pertumb.diteruskan fase kematian, jumlah sel total menurun pemanenan saat
fase eksponensial / stasioner (krn terjadinya sintesis metabolit sekunder).
2) Kultur kontinyu; mikroba ditumbuhkan secara terus menerus pd fase paling optimum fase
pertumbuhan (fase eksponensial) beri nutrien terus menerus secara kemostat (melalui
tanki) komposisi nutrien dlm fermentor tetap (atur aliran medium baru) atau turbidostat,
penambahan nutrien secara kontinyu kerapatan sel (turbiditas kultur) selalu dlm keada-
an tetap. Aliran medium diatur berdasarkan kerapatan optik kultur media.
Bila produk metabolit berpengaruh negatif thd pertumbuhan mikroba (protein rekombinan, yg
gen-nya dari jasad lain) gunakan kultur batch. Bila produksi metabolit sel tdk berpengaruh
thd pertumbuhan selnya gunakan kultur kontinyu (mis. produksi protein / enzim homolog,
protein yg disintesis berdasarkan hasil ekspresi gen alami yg dimiliki jasad tsb. skala besar.
Mikroba juga dpt dimanfaatkan hasilkan produk tertentu dg gunakan medium padat/semipadat
tempe, tape, jamur merang, dll.

Pemanfaatan dlm bioteknologi teknologi DNA rekombinan punya kemampuan fisiolo-

gis yg tdk didpt di alam bakteri / khamir hasilkan protein yg secara alami hanya dihasilkan
jasad tingkat tinggi; mis. Insulin, hormon pertumbuhanl. Bbrp produksi yg dimaksud meliputi:
1) produksi pangan yg dikonsumsi langsung
2) produksi bahan bakuutk pangan
3) produksi utk dukung tahapan seblmpanen (pre-harvest materials)
4) produksi bahan-bahan utk pengelolaan kesehatan
5) produksi bahan-bahan pendukung industri yg lain
Mikroba digunakan sbg.: - agensia produksi; kemampuan mikroba dimanfaatkan utk lakukan
perubahan (biotransformasi) suatu bahan yg diinginkan pd tahap
akhir, sel mikroba dipisah, produk biotransformasi dipanen.
- produk hasil akhir; sel mikroba itu yg dipanen & dimanfaatkan
a) Agensia produk akhir; meliputi:
- produk minuman / beverages: bir, wine khamir
- produk pangan: starter dlm industri keju: Streptococcus, Lactobacillus
- asam-asam amino: L-asam glutamat, phenilalanin, lisin, triptophan
- asam-asam organik: as.fumarat, sitrat, laktat, piruvat
Terkadang agensia produksi sekaligus sbg produk akhir Industri susu fermentasi.
Protein yg gennya berasal dari organisme tingkat tinggi (mis.insulin), dg gunakan mikrob
rekombinan ekonomis (alami: dari pankreas sapi / babi) mahal !
b) Produk akhir: - dikonsumsi langsung bersama substrat: tempe, tape, protein sel tunggal /
single cell protein, (susu + mikroba berguna utk pencernaan).
Mikroba juga dimanfaatkan pd tahapan seblm panen / pre-harvest (utk pupuk / pestisi-
da hayati) kerapatan sel tertentu dipanen; kemas dlm carrier tertentu mis. tanah
gambut. Biasanya campuran bbrp jenis mikroba atau strain berbeda.

Peningkatan kemampuan fisiologis mikroba 2 metoda : konvensional & modern ( tek-

nik mutagenesis, dg mutagen kimia atau mutagen fisik; dan fusi prtoplasma).
1) mutagenesis dg mutagen kimia: ubah karakter mikroba dg ubah urutan nukleotida suatu
gen, meskipun tdk dpt diarahkan secara spesifik acak. Agensia kimia yg digunakan:
a) analog basa dan b) mutagen kimia
Analog basa: senyawa yg memp.struktur kimia mirip dg salah satu basa nukleotida dpt
digabungkan dg mol.DNA dlm proses replikasi. Mutagen kimia adalah senyawa yg dpt
ubah suatu basa nukleotida didlm untaian DNA hingga spesifisitas ikatan hidrogennya
berubah, Mutagen itu sendiri tdk akan tergabungkan ke dlm struktur DNA; mis. HNO2,
hidroksilamin (HA), etilmetan sulfonat (EMS), dan nitroso guanidin (NG); senyawa peng-
interkalasi (proflavin, ethidium bromide) mampu menyisip/interkalasi di antara pa-
sangan basa nukleotida saat DNA direplikasi.
2) Mutagenesis dg mutagen fisik sinar ultraviolet dan radiasi ionisasi distorsi pd struk-
tur DNA hambat proses replikasi DNA replikasi tdk sempurna komposisi genetik
berbeda dari induknya.
3) Mutagenesis secara terarah (Site-directed mutagenesis).
Melibatkan teknik kloning DNA:
a) klon fragmen DNA yg akan dimutasi ke dlm suatu plasmid manipulasi thd fragmen
tsb dg delesi; pemotongan dilakukan enzim restriksi tertentu ligasi kembali
b) sisipkan bbrp nukleotida baru. Fragmen DNA dipotong dg enzim restriksi yg hasilkan
ujung kohesif (mis. EcoRI) perlakuan reparasi DNA secara enzimatis (mis.T4 DNA
polimerase) dihasilkan ujung-ujung fragmen DNA yg pepat (blunt-end) yg mengan-
dung tambahan bbrp nukleotida baru ligasi kembali akhirnya diperoleh fragmen
DNA baru yg mengandung sisipan nukleotida baru.
c) diarahkan oleh oligonukleotida tertentu (oligonucleotide-directed mutagenesisi); me-
rupakan metode paling spesifik; dpt digunakan utk ubah 1 basa tunggal. Fragmen
DNA yg akan dimutasi diklon kedlm vektor DNA untai-tunggal. Digunakan oligonuk-
leotida tertentuu (panjang 7-20 nukleotida) yg komplementerdg bag,tertentu fragmen
DNA yg akan dimutasi. Oligonukleotida itu dirancang memp.1 basa yg tdk dpt berpa-
sangan dg basa yg ada pd lpd fragmen DNA, yaitu basa yg akan dimutasi campur
dg DNA vektor terjadi hibridisasi oligonukleotida pd bag.yg kpmplementer sin-
tesis DNA dg gunakan oligonukleotida yg dihibridisasikan tsb sbg primer. Hasil sinte-
sis berupa mol.DNA untai-ganda transfeksi kedlmsel inang yg sesuai (E. coli)
didpt 2 hasil; koloni yg bawa mol.DNA tipe alami & yg bawa DNA mutan isolasi
kedua DNA hibridisasi dg oligonukleotida pelacak (probe) yg mengandung basa
mutan yg sdh dilabel senyawa radioaktif yg hanya akan berhibridisasi dg mol.DNA
mutan dpt ditentukan koloni yg bawa fragmen gen mutasi. Utk konfirmasi laku-
kan sekuensing DNA dari DNA isolasi yg diduga bawa gen mutan.
 BIOTEKNOLOGI PUPUK HAYATI

Pupuk buatan : artificial chemicall fertilizer; urea, TSP dll.,butuh energi banyak;
dampak lingkungan. Pupuk hayati / biofertilizer; inokulan mikroba alami; ramah
lingkungan; penambat nitrogen; pelarut fosfat. N2 udara, melalui rangkaian reaksi
diazotrofi (penambatan nitrogen secara biologis) senyawa nitrogen yg siap diab-
sorb tanaman. Fiksasi N:
1) secara non-simbiotis free-living microbes: kelompok bakteri & alga biru hijau.
Bakteri penambat N secara non-simbiotis dapat bersifat:
- aerob : Azotobacter, Azospirillum, Derxia, Mycobacterium, Azomonas.
- anaerob: Clostridium, Desulfovibrio, Chlorobium, Chromatium
- fakultatif anaerob: Rhodopseudomonas, Bacillus, Enterobacter.
Dari kelompok sianobakteria: Anabaena, Anabaenopsis, Lyngbya, Oscillatoria,
Nostoc, Calothrix, Plectonema, Stegonema.
Azotobacter; heterotrofik (energi dari sisa-sisa tanaman) banyak dipelajari.
sifatnya: - laju respirasi paling tinggi
- sifat mesofilik, tumbuh pd suhu sekitar 30 oC
- kerapatan di dlm tanah 103 106 sel / g tanah
A. paspali diestimasi memp. kemampuan sumbang 15-93 kg N/ha/thn pd dae-
rah perakaran Paspalum notatum. Beijerinckia (di tanah masam tropis) mampu
hasilkan 50 kg N/ha/thn pd perakaran tanaman tebu. Derxia (pd pH 5,0 9,0).
Dlm kondisi tergenamg, Clostridium acetobutylicum dan C. pasteurianum, jum-
lah meningkat 102 106 sel/g tanah.
Sianobakteri umum di daerah penanaman padi __> membtk heterokist / tidak
 fiksasi N, dan juga sekresikan vit.B12, auksin, & as. askorbat utk pertumb. tanaman.
Fiksasi N secara non-simbiotis: N2 (oleh nitrogenase) NH3. Kompleks nitrogenase ter-
susun atas 2 metalloprotein:
- protein molybdo-ferro (protein Mo-Fe); peran sbg nitrogenase
- protein ferro (protein Fe), peran sbg nitrogenase reduktase
dinon-aktifkan oleh keberadaan oksigen (sifat mutlak anaerob!).
Pd sianobakteri:
- fiksasi N dlm hetercyst; ddgnya mengandung seny.glikolipid yg dpt menambat O2
suasana anaerob.
- tanpa hetercyst (Lyngbya, Oscillatoria) fiksasai N dlm sel yg terkondisi tereduksi.
Pd mikroba non-simbiotik; proses fiksasi N dilakukan dg adanya laju respirasi yg tinggi O2
tdk dpt capai kompleks nitrogenase.
2) secara simbiotis
Bbrp mikroba lakukan penambatan N melalui hub. simbiotik dg tan.tertentu struktur
khusus pd tanaman hub.simbiotik Rhizobium dg tanaman legum.
Rhizobium: bakteri Gram negatif, bersifat aerob, tdk membtk spora, btk batang dg ukuran
(0,5 0,9) x (1,2 3) m; terdpt dlm daerah perakaran, simbiosis dg tan.legum khusus.
4 kelompok bakteri pembtk bintil akar:
- Genus I: Rhizobium; tumbuh cepat/fast growing bacteria: R. leguminosorum, R.meliloti
- Genus II: Bradyrhizobium; tumbuh lambat/slow growing bacteria: B. japonicum.
- Genus III: Sinorhizobium; tumbuh lebih cepat: Rhizobium fredii; simbiosis dg kedelai.
- Genus IV: Azorhizobium; membtk bintil batang pd Sesbania: A. caulinodans.
Frankia (Actinomycetes) simbiosis dg Alnus, Myrica, Casuarina membtk bintil akar tipe corra-
loid (bercabang-cabang) & tipe Casuarina, apeks bintil akar membtk akar geotropik.
 Simbiosis Rhizobium - legum dicirikan pembtkan bintil akar pd tan.legum (inang)
diawali dg sekresi produk metabolisme tan. ke daerah perakaran stimulasi pertumbuhan
bakteri; tdk hanya Rhizobium.Tahapan pembtkan bintil akar umumnya:
1) Pengenalan pasangan yg sesuai antara tanaman-bakteri pelekatan bakteri Rhizobium
pd permukaan rambut akkar tanaman.
2) Invasi bakteri ke dlm rambut akar melalui pembtkan benang infeksi / infection thread.
3) Perjalanan bakteri ke akar utama melalui benang infeksi.
4) Pembtkan sel-sel bakteri yg alami deformasi (bakteroid), di dlm sel akar tanaman.
5) Pembelahan sel tanaman dan bakteri terbtk bintil akar.
Pelekatan Rhizobium pd rambut akar dpt terjadi karena pd permukaan bakteri itu terdpt suatu
protein pelekat: rhicadhesin (protein pengikat kalsium yg berfungsi dlm pengikatan kompleks
Ca pd permukaan akar) dan lectin / phytoagglutinin (protein berkarbohidrat, berperan dlm
pengikatan bakteri.
Penetrasi awal ke rambut akar dilakukan melalui ujung rambut akar rambut akar meng-
gulung akibat sekresi bakteri (seny.faktor Nod) masuk rambut akar induksi pembtkan be-
nang infeksi (tabung selulosa) bakteri dlm benang infeksi tumbuh ke arah sel-sel akar
faktor Nod (dihasilkan bakteri) stimulasi pembelahan sel-sel tanaman bintil akar. Selanjut-
nya bakteri tumbuh cepat dan alami perubahan bentuk jadi bakteroid (struktur bercabang), di-
kelilingi peribakteroid (membran sel tanaman) barulah terjadi penambatan nitrogen.
Tanaman mati bintil akar rusak, bakteri terlepas keluar sel akar; bakteroid tdk mampu
membelah lagi; sebagian dorman (yg bukan bakteroid) dpt infeksi akar legum lagi. Selama
pembtkan bintil akar, banyak gen tanaman & Rhizobium yg diekspresikan secara berurutan.
Tahap tertentu nodulin (hasil ekspresi gen tanaman); a) protein yg jaga struktur bintil akar;
b) protein yg dukung fungsi bakteroid (fiksasi N), dan c) protein/enzim yg diekspresikan selama
proses metabolisme dan asimilasi nitrogen.
Perkembangan bintil akar dipengaruhi bbrp faktor:
1) konsentrasi nutrien anorganik
2) suhu tanah (25 30 0C utk pembtkan bintil optimum, > /< akan terhambat)
3) cahaya & naungan (cahaya: tingkatkan jumlah bintil; naungan: menurunkan)
4) konsentrasi CO2 (konsentrasi tinggi tingkatkan jumlah bintil akar)
5) ketersediaan N dlm tanah (tinggi kurangi jumlah dan berat bintil akar)
6) keberadaan mikroorganisme lain di dlm rhizosfer.
Mekanisme penambatan N di dlm bintil akar
Bintil akar legum merah (pigmen leghaemoglobin (LHb) yg mengandung Fe; myoglo-
bin pd hewan.; hanya pd akar sehat. Yg tdk sehat, bintil akar putih tdk bisa fiksasi N. LHb
berada di luar membran bakteroid, berfungsi atur konsentrasi oksigen krn bakteroid bersifat
aerob. Fiksasi N sangat peka thd keberadaan oksigen (> 0,5 atm hambat fiksasiN krn terja-
di pe-nonaktif-an kompleks nitrogenase. Dalam hal ini,LHb berfungsi sbg:
- fasilitator pengambilan oksigen oleh enzim oksidase terminal dan tingkatkan produksi
ATP utk aktivitas nitrogenase.
- pencipta suasana anaerob di sekitar nitrogenase (gabung dg oksigen oxyhaemoglo-
bin (OLHb) hingga O2 tersedia di permukaan membran sel bakteri OLHb bantu pro-
ses respirasi bakteri & sediakan ATP utk tambat N sekaligus lindungi kompleks nitroge-
nase dari pengaruh oksigen.
Dlm proses penambatan nitrogen:
- nitrogenase reduktase (protein Fe) berinteraksi dg ATP dan Mg++
- nitrogenase (protein Mo-Fe) mengkatalisis reduksi N2, H+, asetilen > NH3, H2 , etilen.
Selama fiksasi N, sumber reduktan utk transfer elektron berasal dr ferredoxin / flavodoxin
yg tereduksi berikan elektron ke protein Fe hingga reduksi protein Mo-Fe, diikuti pelepas-
an P anorganik; kompleks nitrogenase peroleh energi dari ATP hasil respirasi protein
Mo-Fe berikan elektron ke substrat yg dpt direduksi, misalnya N2.
Secara umum reaksi fiksasi N pd bintil akar:

N2 + 16 ATP + 8e- + 10 H+ 2 NH4+ + H2 + 16 ADP + 16Pi

Mg++

Amonia adalah produk stabil I pd proses fiksasi N ditransfer melalui membran bakteroid
ke del tanaman digunakan dlm metabolisme tanaman.

Sianobakteri yg membentuk asosiasi simbiotik, yg memp. Heterocyst yaitu Anabaena azo-

llae bersimbiosis dg Azolla (Pteridophyta). Anabaena berasosiai dg rambut multiselular dlm
rongga khusus daun Azolla; berperan dlm transfer N dari mikrosimbion dan tan.inangnya. Pe-
nambatan N terjadi dlm heterocyst. Azolla banyak digunakan sbg pupuk hijau pd petanaman
padi.A. filiculioides mampu tumbuh lebih cepat; 50 hari dpt hasilkan biomassa 1700 kg b.k./ha
yg mengandung nitrogen 52 kg N/ha. Azolla mudah terkomposisi menjadi ammonia
potensi sediakan unsur N yg dibutuhkan tanaman padi.

Mikroba pelarut fosfat mampu lakukan pelarutan (solubilization) fosfat dari sumber fos-
fat (batuan fosfat); bakteri ( Pseudomonas, Bacillus) dan jamur (Penicillium, Aspergillus). Ke-
mampuan larutkan fosfat krn sekresikan as.organik format, asetat, propionat, laktat, glikolat,
fumarat, dan suksinat pH tanah turun fosfat larut as. hidroksi meng-chelate Ca & Fe
pelarutan dan penggunaan fosfat lebih efektif. Ca3(PO4)2 H2(PO4)- dan H(PO4)= sbg
hara P yg tersedia bagi tanaman. Jumlah fosfat terlarut yg dihasilkan mikroba heterotrof ber-
Variasi dg banyaknya karbohidrat yg dioksidasi; dan transformasi itu umumnya terjadi bila
substrat berkarbon diubah jadi as,organik. As.nitrat & sulfat yg dihasilkan dlm oksidasi bahan
nitrogen atau seny,anorganik sulfur bereaksi dg batuan fosfat hingga tingkatkan jumlah fosfat
terlarut.
Teknik dasar pembuatan pupuk hayati dibutuhkan 4 komponen:
a) mikroba yg sesuai utk suatu jenis pupuk hayati bila > 1 mikroba, hati-hati !
b) medium utk perbanyakan sel mikroba yg akan digunakan
c) bahan pembawa / carriermikroba
d) bahan pengemas / packaging materials
Bila > 1 mikroba (beda strain, spesies, atau genus) lakukan uji antagonistik !
setiap macam mikroba kultur dulu terpisah dlm medium yg paling sesuai sebelum
dikemas. Secara umum, tahap produksi inokulan mencakup:
1) isolasi dan skrining mikroba yg akan digunakan sbg pupuk
2) perbanyakan mikroba dlm medium yg tepat
3) pencampuran dg bahan pembawa / carrier; 4) pengemasan

Idealnya, mikroba diisolasi dari habitat lokal adaptasi mudah pd lingkungan tem-
pat aplikasi. Menurut Keyer dkk. (1993) inokulan Rhizobium tsb. sebaiknya:
1) mampu membtk bintil akar & menambat N pd tan. legum targetnya
2) mampu infeksi & membtk bintil akar meskipun ada rhizobial pesaing
3) mampu menambat N dlm kisaran kondisi lingkungan yg luas
4) mampu btk bintikl akar& menambat N meski ada N di dlm rtanah
5) tumbuh baik dlm medium perbanyakan, dlm carrier, dan dlm tanah
6) persisten di dlm tanah;, khususnya utk kepeluan penanaman kembali
7) mampu bermigrasi dari ttk awal inokulasi
8) mampu mengkolonisasi tanah tanpa ada pengaruh akar tan.inang
9) toleran thd cekaman lingkungan
10) mampu dukung fiksasi N dlm asosiasinya dg kisaran kultivar tan. yg luas
11) sesuai / kompatibel dg bahan kimia yg digunakan dlm pertanian
Medium kultur utk Rhizobium YEMA ( Yeast Extract Manitol Agar); perlu subkultur !
Komposisi YEMA (manitol bisa diganti sukrosa atau glukosa):
Komponen Berat /L (g)
K2HPO4 0,5
MgSO4 0,2
NaCl 0,1
Manitol* 10,0
Yeast extract 1,0
Akuades 1000
Agar 20

Perbanyakan dilakukan dlm fermentor besar dilengkapi alat atur pH, oksigen terlarut, suhu
dan penggojlok; atau tabung erlenmeyer dg shaker yg diatur kecepatannya.
Carrier yg digunakan dlm pembuatan pupuk hayati sebaiknya bersifat:
1) memp. Kkemampuan tinggi dlm menahan air
2) tdk toksik bagi mikroba
3) mendukung pertumbuhan mikroba
4) secara umum steril atau sdh disterilkan
5) bahan mudah diperoleh dg harga murah
6) mep.daya lekat thd benih
7) memp. Komposisi seragam secara kimia
8) mudah diatur pH-nya
9) mudah didegradasi, tidak mencemari lingkungan
10) mudah melepaskan mikroba bila digunakan di tanah
11) mudah dicampur dan dikemas
 Gambut ideal sbg carrier; dpt pula digunakan lignite, arang, vermiculite, zeolite, dll. Biasa-
nya ditambahkan pula bahan lain spt kapur dan lempung, utk atur pH, peroleh tekstur bahan
Inokulan yg baik dan mudah dikemas serta digunakan kemas dlm kantong kuat tapi lentur
tdk mudah sobek atau bocor aluminum foil. Inokulan dicampur benih yg akan ditanam, bi-
asanya dipakai 4-6 g inokulan/kg benih.

Produksi inokulan Azotobacter

Kemampuan fiksasi N Azotobacter 2-15 mgN/gsumber karbon yg digunakan, sifat hidup
bebas, inang tdk spesifik; juga mampu hasilkan metabolit lain yg bermanfaat bagi pertum-
buhan tanaman spt,: auksin, thiamin, riboflavin, pyridoxin, as.nikotianat, giberelin, dll. Juga
hasilkan antibiotik anti jamur baik utk perkecambahan.
Prinsip dasar produksinya = Rhizobium. Perbanyakan dpt dilakukan dg medium cair dlm
fermentor atau dg tabung erlenmeyer. Bahan pembawa dibuat bubuk dulu, dinetralkan dg
CaCO3 dan dicampur dg kultur cair, baru dikemas inokulan berbtk bubur benih dicam-
purkan keringkan dlm kondisi teduh tanam. Bila sistem penanaman melalui benih
celupkan akar bibit ke dlm bubur inokulan selama 10-30 menit sebelum ditanam. Dlm skala
kecil kultur medium agar kerok dari agar suspensikan dlm akuades steril lang-
sung gunakan sbg inokulum.

Sianobakteri / blue green algae sbg pupuk hayati

Sifat fotosintetik dan mampu fiksasi N; Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc, Stigonema, dll.
Juga sekresikan auksin, vit.B12, dan as. askorbat. tingkatkan pertumbuhan padi. Nitrogen
fiksasi akan dilepas ke lingkungan dlm btk asam-asam amino, protein, dan ZPT. Utk pertum-
buhan alaga diperlukan cahaya; inkubasi bbrp minggu pd 28-32 0C. Koloni alga yg terpisah
Ambil & pindahkan ke medium padat / cair utk identifikasi atau simpan sbg kultur stok.
Metoda yg paling umum digunakan dlm penyiapan alga sbg pupuk hayati: metoda lubang
polythene, dibuat lubang-lubang kecil di sawah/lapangan; tutup dg lembar polythene tebal.
Masukkan campuran10 kg tanah dan 200 g superfosfat ke dlm lubang, isi air 10 cm; utk
atur pH (=7) gunakan kapur. Setelah tanah mengendap taburkan inokulum 100 g ke
permukaan air sekitar 1 minggu mulai pertumbuhan alga di permukaan air biarkan air
mengering biomassa alga dikeringkan dpt digunakan 1 minggu setelah penanaman
padi dg dosis 10 kg/ha.

Penggunaan fungi vesikular-arbuskular mikoriza (VAM) sbg pupuk hayati

VAM: jamur non-patogenik yg berasosiasi dg kelompok tumb.tertentu. Ada 3 asosiasi
mikoriza: 1) ektomikoriza, pembtkan selubung miselium jamur di sekitar akar tumbuhan
2) endomikoriza, jamur invasi ke dlm akar tumbuhan utk bersimbisis
3) ektendomikoriza, infeksi jamur ektotrofik, hifa terkumpul di dlm sel korteks.
Asosiasi VAM berperan bantu serap fosfat dari tanah, meningkatkan pertumbuhan seca-
ra signifikan pd tanah yg kekurangan fosfat; jugabantu serap unsur mikro, tingkatkan ZPT,
pembtkan bintil akar, serta toleransi tanaman thd cekaman kekeringan.
VAM bersifat simbion obligat tdk dpt ditumbuhkan pd medium buatan terpisah dari
tanamannya penyiapan inokulum berbeda. VAM dpt dihasilkan dg gunakan kultur pot.
Inokulum (spora) yg digunakan sbg starterdpt diperoleh dari tanah dg cara penyaringan
spora yg diperoleh sterilkan permukaannya dg chloramin T dan streptomisin cuci air steril.
Penyiapan kultur VAM tanpa tanah akan mengurangi risiko terbawanya mikroba tanah
lainnya yg merugikan misalnya gambut, perlite, vermicullite, pasir, kulit kayu yg diha-
luskan. Aplikasi mikoriza dilakukan dg menempatkan inokulum di bawah benih atau bibit
seblm ditanam. Utk tingkatkan keberhasilan, sering VAM dikombinasi dg inokulum lainnya
yg sesuai utk 1 jenis tanaman, mis. Dg Rhizobium.
Skema pembuatan inokulum VAM Tanah

Sterilisasi spora VAM

Spora VAM

Pot steril (diisi pasir dan tanah steril 1:1)

Tanaman inang ditumbuhkan pada pot

Bibit ditanam

Dicek keberadaan spora pada akar

Akar dipotong dan dogunakan sbg inokulum awal

Inokulum awal (starter) dibenamkan di pot dan benih ditumbuhkan di sekitarnya

Inokulasi pot yg lebih besar

Bibit diambil setelah 3-4 bulan

Akar dihaluskan bersama-sama tanahnya

Inokulum VAM siap

Beberapa Penanda Resistensi terhadap Antibiotik atau Herbisida
Ekspresi gen asing dlm tan.transgenik dpt dianalisis secara in vivo maupun in vitro. Analisis
in vitro dpt dilakukan dg: (1) uji enzimatik, (2) uji aktivitas protein pd gel, (3) uji imunokimia
Uji enzimatik dilakukan dg ukur aktivitas produk ekspresi gen reporter yg berupa enzim
dg gunakan metode kolorimetri, fluorometri, atau luminometri. Aktivitas enzim tsb dikuantifi-
kasi dg menambahkan substrat yg dpt diubah aktivitas katalitik enzim tsb jadi suatu produk.
Mis.aktivitas protease diuji dg menambahkan suatu protein yg dpt didegradasi enzim itu ja-
di peptida; jmlh peptida yg terbtk dianalisis utk tahu gambaran aktivitas proteolitik enzim itu.
Uji aktivitas protein pd gel; protein-protein hasl ekspresi gen pd jar.tanaman dpt dianalisis
dg cara melakukan elektroforesis pd gel poliakrilamid muncul pita-pita berbagai ukuran
analisis aktivitas enzimatiknya dg fluorometri.
Uji imunokimia, utk uji protein asing yg bukan enzim gunakan antibodi thd protein itu
uji imunokimia dg teknik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) atau immunoblotting.
Teknik transfer gen asing ke dlm tanaman
Transfer gen suatu jasad ke tana. dpt dilakukan dg (A) transformasi protoplas, (B) trans-
formasi sel / jar.tanaman sifat totipotensi sel tanaman.
(A) Transformasi protoplas
Protoplas memp.kelebihan utk digunakan sbg bahan awal transfer gen asing ke dlm tan.:
Krn transfer gen (plasmid rekombinan) terjadi hanya melalui membran sel (ddg sel sdh dihi-
Langkan), dan semua sel tan.transgenik yg diregenerasi dr prtoplas akan mengandung gen
asing tg diinginkan tan.memp.komposisi genetik yg seragam.Transformasi protoplas dg
gen asing dpt dilakukan dg bbrp cara:
a. gunakan senyawakimia tertentu, mis.PEG
b. teknik elektroporasi
c. gunakan perantara bakteri A. tumefaciens
d. transfer gen dg sonifikasi
e. transfer gen dg perantaraan liposome.
 Liposome dpt digunakan utk transfer gen asing ke dlm protoplas tanaman; liposome yg
bawa plasmid difusikan dg protoplas menggunakan PEG; kelebihan teknik ini: (1) DNA ter-
Lindungi dari kemungkinan adnya aktivitas nuklease, (2) toksisitas liposome rendah, (3)
DNA yg ada dlm liposome lebih stabil dlm penyimpanan, dan (4) dpt diaplikasikan pd ba-
nyak tanaman.

(B). Transformasi sel atau jaringan tanaman yg utuh.

Transfer dpt digunakan dg metoda: (1) transformasi gunakan perantara A. tumefaciens,
(2) biolistik, dan (3) mikroinjeksi / makroinjeksi. (lihat skema di halaman berikut !)
(1) Transformasi tan.dg perantaraan A. tumefaciens.
Plasmid rekombinan dibuat dg menyisipkan gen asing ke dlm T-DNA yg ada pd plasmid
Ti pindahkan plasmid rekombinan ke dlm bakteri A. tumefaciens. Hal ini dpt dilaku-
kan dg menggunakan teknik konyugasi antara bakteri E. coli yg membawa plasmid re-
kombinan, dg bakteri A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti sbg plasmid pembantu (helper
plasmid).
Sel A. tumefaciens yg sdh membawa gen rekombinan selanjutnya ditumbuhkan bersa-
ma jar.tan.yg akan ditransformasi (disebut teknik ko-kultivasi). Jar.tan.yg akan di-
kokultivasi dg A. tumefaciens dpt diambil dari irisan daun (leaf disc) celupkan seben-
tar ke dlm kultur A. tumefaciens berumur semalam letakkan pd kertas filter steril
letakkan pd medium selektif utk proses ko-kultivasi dg bakteri A. tumefaciens 2-3 hari.
Medium itu juga mengandung antibiotik yg sesuai, herbisida atau bahan kimia lain yg
bersifat selektif hanya jar. tan,.yg telah alami transformasi saja yg tetap dpt tumbuh.
Jaringan tanaman yg tumbuh tsb. diteruskan sampai berkembang membtk bakal tanam-
an (plantlet) pindahkan ke pot berisi tanah utk pertumbuhan lanjut. Utk analisis keber-
hasilan: uji dg teknik DNA blotting, PCR, atau analisis ekspresi gen asing yg disispkan.
Skema Transfer Gen
Asing (DNA
Rekombinan) ke
dalam Sel Tanaman
untuk Menghasilkan
Tanaman Transgenic.
Selain ketiga metode
tersebut masih ada
metode lain yaitu
mikroinjeksi dan
makroinjeksi.
Skema Transformasi Tanaman
Menggunakan Teknik Ko-kultivasi
dengan Bakteri Agrobacterium
tumefaciens yang Membawa Plasmid
Rekombinan. Dalam skema di
samping digunakan contoh
penggunaan sistem plasmid biner
untuk kloning gen asing ke dalam
tanaman.
Skema Alat Biolistik untuk Melakukan Transformasi Sel Tanaman
Beberapa macam tanaman transgenik yg sudah dikembangkan

Spesies tanaman Gen yg disisipkkan Asal gen Karakterbaru yg

diperoleh
Oryza sativa Gen pengkode:
(Golden rice) Phyton synthase Daffodil Produksi provitamin A
Lysopene cyclase Daffodil (-karoten) pd endo-
Phytoene desaturase Erwinia carotovora sperm
Oryza sativa Gen phosphinothricin Streptomyces Toleransi thd herbisida
N-acetyltransferase hygroscopicus phosphinothricin, khusus
nya glufosinate amonium
Lycopersicum Gen pengkode S-ade Bakteriofag T3 Penundaan pemasakan
esculentum Nosylmethionine krn biosihtesis etilen ber-
hydrolase kurang
Zea mays Gen pengkode toksin B, thuringiensis Resisten thd pengerek
CrylAb subsp. Kurstaki Batang Ostrinia subilalis
Carica papaya Gen pengkode coat Papaya Ringspot Resisten thd PRSV
protein Papaya Ring- Virus
spot Virus (PRSV)
Glycine max L. Gen pengkode -12 Kedelai Akumulasi as.lemak oleat
Desaturase (fad 2) as.lemak tak jenuh
PERTANIAN
 BRAVO KAWENGIAN
KEZIA MANONGKO